背景:尽管通过人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）疫苗接种和筛查几乎可以完全预防宫颈癌,但宫颈癌仍是世界范围内影响妇女健康的重要公共卫生问题。我国每年宫颈癌新发病例高达世界总数的1/4,,其死亡率高居女性恶性肿瘤死亡的第二位,并且年轻化趋势明显。随病情发展晚期宫颈癌五年生存率不足20%。尽管早期宫颈癌经过手术联合辅助治疗（化疗、放疗或两者结合）已取得满意的局部控制率,但肿瘤进展到晚期或转移期时预后极差,常规放化疗的结果并不理想,更突出了开发新疗法的重要性。蜂毒肽（Melittin）是蜂毒中主要的多肽成分,具有优异的溶细胞特性且不产生耐药性,是研究最广泛的两亲性阳离子透膜肽。Melittin在体外细胞培养和动物模型中显示出多种抗癌作用,通过破坏细胞膜诱导肿瘤坏死或凋亡。但由于非特异性细胞毒性、强溶血活性和生物利用率低的问题限制了Melittin的临床应用。针对上述问题,以Melittin主体为基础研制了新型融合肽UM-6。初步研究表明UM-6不仅保留了对肿瘤细胞的毒性作用,同时又避免了Melittin因为溶血而对正常细胞损伤等缺陷,但其具体的作用机制及体内应用的安全性和有效性仍待进一步探索。目的:研究新型融合肽UM-6引起宫颈癌细胞死亡的具体模式和发挥抗宫颈癌作用的机制;研究不同给药模式下UM-6体内应用的安全性和有效性,为UM-6临床前研究打下基础。方法:（1）UM-6溶血性和细胞摄取检测。根据Melittin和UM-6的分子量计算其摩尔浓度,用溶血实验比较相同摩尔浓度下Melittin和UM-6的溶血率;用FITC标记的UM-6处理宫颈癌细胞,在不同的时间点使用共聚焦显微镜观察UM-6的亚细胞定位。（2）UM-6对宫颈癌细胞增殖的影响。分别用0-80（?）g/ml UM-6处理Hela,Caski,Si Ha,ME180和C33A宫颈癌细胞系24小时和48小时,用MTT法检测宫颈癌细胞的生存,计算UM-6的半数抑制浓度（IC50）;用0-30（?）g/ml UM-6处理上述宫颈癌细胞系,通过平板克隆实验来检测UM-6对克隆形成的影响。（3）UM-6对宫颈癌细胞迁移和侵袭的影响。用0-30（?）g/ml UM-6处理Hela和Caski细胞,通过Transwell实验和3D侵袭实验检测Hela和Caski细胞的迁移和侵袭能力;通过Immunoblotting检测E-cadherin,N-cadherin,MMP9,Twist1,Vimentin和β-catenin的蛋白表达。（4）UM-6对宫颈癌细胞凋亡的影响。用0-30（?）g/ml UM-6处理Hela和Caski细胞。通过TUNEL法标记细胞凋亡晚期的基因组DNA断裂;通过流式细胞术检测凋亡时细胞膜外翻的磷脂酰丝氨酸（Annexin V）:通过Immunoblotting检测线粒体凋亡途径中Bax和Bcl-2的表达。以及凋亡起始半胱天冬酶Caspase9和Caspase8,凋亡执行半胱天冬酶Caspase3,以及Caspase的切割底物Cleaved-PARP1的表达。（5）UM-6对宫颈癌细胞自噬流量的影响。GFP-LC3和m Cherry-GFP-LC3腺病毒转染Hela和Caski细胞48小时,用30（?）g/ml UM-6处理24小时后在共聚焦荧光显微镜下量化LC3点状聚集的数量;将自噬早期阶段抑制剂渥曼青霉素（Wortmannin,WM）与自噬晚期阶段抑制剂氯喹（CQ）和巴弗洛霉素A1（Baf A1）与UM-6联合用药,通过免疫荧光检测LC3、p62和LAMP1共定位情况;通过Immunoblotting检测自噬相关标记物LC3、p62和LAMP1的表达;使用小干扰RNA（Si RNA）抑制自噬相关基因（ATG5和ATG7）,以研究自噬在UM-6引起的细胞死亡中的作用。（6）研究YAP在宫颈癌中的表达。通过组织芯片检测YAP在宫颈癌和正常组织中的表达及亚细胞定位;通过Immunoblotting检测临床宫颈癌样本YAP的表达;通过c Bio Portal在线工具分析YAP基因在不同类型肿瘤中的改变。（7）研究UM-6对Hippo通路的影响。用UM-6处理Hela和Caski细胞,免疫荧光（IF）检测YAP的细胞核定位;Immunoblotting检测LATS1总蛋白、磷酸化LATS1-Thr1079,磷酸化LATS1-Ser909,YAP总蛋白,磷酸化YAP-Ser127和磷酸化YAP-Ser397的表达;分别提取细胞质和细胞核蛋白检测YAP的表达;通过双荧光素酶报告基因检测和q RT-PCR检测UM-6对YAP转录活性的影响;通过免疫共沉淀检测YAP蛋白的泛素化水平;使用Si RNA抑制YAP表达,通过Immunoblotting检测CleavedCaspase9,Cleaved-PARP1,LC3和p62的表达,以研究YAP对宫颈癌细胞凋亡和自噬的作用。（8）UM-6体内给药安全性检测与体内治疗剂量探索。利用Hela细胞构建裸鼠皮下异种移植模型,将裸鼠随机分为五组（每组5只）:a)PBS组;b)IFN组;c)顺铂（CDDP,25mg/kg）组;d)UM-6（4mg/kg）组;e)UM-6（8mg/kg）组;f)UM-6（12mg/kg）组。每两天腹腔注射上述药物,同时监测肿瘤生长,共治疗9次。在治疗结束后小鼠收集血清,使用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、心肌酶（Myocardial enzyme）、雌激素（Estrogen）、谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平的变化,以评估UM-6体内应用的毒性,同时根据治疗效果选择有效的治疗剂量。（9）UM-6在体内应用有效性和作用机制的研究。利用Hela细胞构建裸鼠皮下异种移植模型,将裸鼠随机分为两组（每组5只）,每两天腹腔注射UM-6（8mg/kg）或者生理盐水,监测肿瘤生长,共治疗9次。在治疗结束后收集肿瘤并称重,分别将瘤体进行石蜡包埋后行免疫组织化学（IHC）检测,OCT包埋后行冰冻切片免疫荧光检测,提取组织蛋白后通过Immunoblotting检测自噬、凋亡和Hippo通路相关蛋白的表达,以验证体外实验得出的结论。（10）UM-6体内抑制宫颈癌转移的研究。利用Hela细胞构建裸鼠腹腔种植转移模型,每两天尾静脉注射UM-6（8 mg/kg）或者生理盐水,共治疗17次。治疗结束后对小鼠对腹腔内肿瘤负荷进行评估,收集所有转移瘤拍照称重,对肝脏转移瘤拍照称重后行病理学检查。结果:（1）UM-6溶血性较Melittin明显改善,UM-6浓度达到64（?）M时仅仍未见明显溶血,而Melittin浓度为2（?）M时就有50%红细胞完全裂解。用UM-6处理宫颈癌细胞5分钟后即可观察到其细胞质中富集,说明UM-6在降低溶血性的同时仍能被肿瘤细胞摄取。（2）UM-6能够在体外抑制宫颈癌细胞系Hela,Caski,Si Ha,ME180和C33A的增殖和克隆形成,且UM-6对人类角质细胞Ha Ca T和正常上皮细胞系MCF-10A毒性较低。（3）UM-6能够在体外抑制宫颈癌细胞系Hela和Caski的迁移和侵袭,抑制上皮-间质转化（EMT）过程。（4）UM-6能够促进宫颈癌细胞凋亡（I型细胞死亡）。UM-6促进线粒体外膜通透性（MOMP）的增加,激活Caspase级联反应,激活内源性与外源性凋亡途径。（5）UM-6诱导宫颈癌细胞自噬体的积累,促进自噬体和溶酶体的结合和周转,激活自噬流量。自噬流量的增加促进自噬依赖的细胞死亡（Ⅱ型细胞死亡）,药理性抑制自噬或沉默自噬相关基因ATG5和ATG7能够部分逆转UM-6诱导的细胞死亡。（6）YAP在宫颈癌进展过程中过度激活,在宫颈癌样本的细胞质和细胞核中检测到YAP的中/强IHC染色,但细胞核YAP免疫信号的阳性率和强度明显更高。且YAP在不同类型的癌症中经常发生扩增。（7）UM-6能够激活Hippo通路,促进YAP蛋白的降解,抑制YAP转录活性。UM-6促进LATS1在Thr1079和Ser909位点的磷酸化,导致YAP在Ser127位点磷酸化后与14-3-3蛋白结合和细胞质保留;以及YAP在Ser397位点磷酸化后通过泛素-蛋白酶体系统的降解。UM-6能够抑制YAP蛋白的细胞核定位,抑制YAP-TEAD相互作用和靶基因的转录。（8）UM-6体内应用未见明显毒性,主要生化指标肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、心肌酶（Myocardial enzyme）和雌激素水平在各组间无明显差异。当UM-6治疗剂量为8mg/kg时,其抑瘤率与顺铂相当。（9）UM-6能够抑制裸鼠异种移植瘤的增殖,具体机制与激活凋亡、自噬和Hippo通路相关。（10）尾静脉注射UM-6能够抑制裸鼠腹腔种植模型的肿瘤负荷和转移范围,抑制肝脏转移性结节的大小和范围。结论:（1）UM-6在降低溶血性的同时保留了其抗宫颈癌活性,且体内给药未见明显的毒副作用。（2）UM-6在体外和体内均抑制宫颈癌增殖,主要机制是UM-6激活细胞凋亡和自噬依赖的细胞死亡,在UM-6治疗的宫颈癌细胞中观察到激活的线粒体凋亡途径和Caspase级联依赖的凋亡途径（I型细胞死亡）;同时观察到自噬流量的增加,包括自噬体的合成增加和自噬溶酶体的积累,这被认为是促进肿瘤细胞死亡的毒性自噬（Ⅱ型细胞死亡）。增加的自噬流量与凋亡途径协同作用,共同促进宫颈癌细胞的死亡。（3）UM-6在体外和体内均抑制宫颈癌侵袭,UM-6抑制上皮-间质转化过程,抑制腹腔种植小鼠模型的转移。（4）YAP在宫颈癌样本中呈中/高表达。UM-6在体外和体内均能激活Hippo通路,促进YAP蛋白以LATS1蛋白磷酸化依赖的方式降解和细胞质保留,抑制YAP蛋白的细胞核定位和转录活性。