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锰氧化物是Mn(Ⅱ)经氧化后形成的、具有很高反应活性的矿物成分，决定着环境中许多物质的形态、迁移和转化，而微生物的Mn(Ⅱ)氧化作用被认为是自然界锰氧化物形成的主要驱动力。尽管国内外对于微生物尤其是细菌的Mn(Ⅱ)氧化作用机制已经有较多研究，但是这些研究多集中于海洋或淡水环境中的Mn(Ⅱ)氧化细菌，而关于土壤中Mn(Ⅱ)氧化细菌的相关研究则鲜见报道。本研究以一株具有高锰氧化活性的土栖性大肠杆菌(Escherichia coli) MB266菌株为对象，通过转座突变文库筛选、基因中断与表达互补、细胞表面展示分析和体外活性组分试验等多重手段，对该菌株细胞表面由多铜氧化酶激发Mn(Ⅱ)氧化作用的分子机制进行了解析，并对生物氧化形成的锰氧化物用于降解内分泌干扰物和构建生物传感器的性能进行了研究。主要研究内容和结果如下: 1.对从棕壤不同土层中分离鉴定的6株高Mn(Ⅱ)氧化活性细菌用k培养基进行7d富Mn(Ⅱ)连续培养，发现这些菌株所产生的锰氧化物浓度随培养时间增加而增加并在5d后达到峰值，而培养液的pH值稳定在pH8以下，从而初步证实其锰氧化物由生物氧化作用形成。有趣的是，SEM观察到其中5株分离菌株培养后期的培养物与所形成的锰氧化物裹挟形成规则的球形聚集体，另1株分离菌株不形成聚集体。EDX分析证实这些聚集体主要组成元素为C，O和Mn。XRD分析显示这些细菌形成的锰氧化物与土壤中存在的锰氧化矿物组分之间可能存在关联性。 对从土壤中分离的一株大肠杆菌MB266的测定结果显示该菌株具有最高锰氧化活性，SEM/TEM观测到在富Mn(Ⅱ)培养下该菌细胞表面可形成黑色沉积层，并在连续培养后期形成直径约10μm的聚集体。从MB266菌株转座突变文库的活性衰减突变株中发现转座插入位点侧翼序列为一种多铜氧化酶(Multicopper oxidase，MCO)基因。利用Real time-qPCR测定显示MB266菌株的MCO编码基因是所检测的30个可能的Mn(Ⅱ)氧化相关基因中唯一的在Mn(Ⅱ)胁迫下表达水平升高的氧化还原酶类基因。这些结果显示MB266菌株的多铜氧化酶与生物锰氧化作用存在关联性。从MB266基因组中扩增MCO基因，命名为mco266。通过构建重组质粒异源表达mco266基因，获得纯化的MCO266蛋白。体外试验显示纯化MCO266、受体菌大肠杆菌JM109以及胞内表达MCO266的JM109重组菌全细胞无Mn(Ⅱ)氧化活性。 为进一步证实该菌的锰氧化作用发生于其细胞表面，利用来自于丁香假单胞菌冰核蛋白InaQ的N-末端(InaQ-N)作为运载蛋白、MCO266为目标蛋白构建了大肠杆菌细胞表面展示MCO266的表面展示工程菌MB253，结果发现工程菌MB253有较高的Mn(Ⅱ)氧化活性，而体外MCO266纯化蛋白和MB253细胞外膜组分混合实验亦显示Mn(Ⅱ)氧化活性，但可为蛋白酶K抑制。不仅如此，MCO266纯化蛋白在体外与无锰氧化活性的JMI09的细胞外膜蛋白组分混合时也显示了Mn(Ⅱ)氧化活性。这些结果证实MCO266的Mn(Ⅱ)氧化作用发生在细胞表面，且需要细胞外膜蛋白的参与。通过表达纯化MB266菌株的细胞色素成熟酶系的CcmF, G和H组分、以及胞内共表达MCO266与CcmFGH，未检测到混合组分或共表达重组菌的Mn(Ⅱ)氧化活性。表面展示重组菌在连续富Mn(Ⅱ)培养下亦可形成聚集体。XPS实验证实了聚集体主体为锰氧化物，且不同重组体形成的锰氧化物比例不同。XRD实验证实MB266，MB253和MB267菌株形成的锰氧化物结晶为方铁锰矿。红外光谱测试证实一些小分了物质也参与了氧化反应。研究亦证实培养基中的初始Mn(Ⅱ)浓度和细胞营养状况不仅影响野生菌株和表面展示重组菌的全细胞锰氧化活性，而且也影响到是否可形成聚集体和聚集体的形态。在以上研究的基础上，提出了在大肠杆菌细胞表面由多铜氧化酶介导的Mn(Ⅱ)氧化作用可能的分子机制。 2.首次利用多铜氧化酶和生物氧化形成的锰氧化物的高氧化活性生物降解系统对内分泌干扰物(EDCs)的降解活性进行了研究。利用大肠杆菌表面展示多铜氧化酶CotA并且形成锰氧化物的特点，构建了一种新型的EDCs降解系统。该系统由表面展示CotA重组菌MB500活细胞和由其氧化Mn(Ⅱ)形成的聚集体构成，同时具有多铜氧化酶的氧化活性和锰氧化物高氧化活性的双重氧化作用。结果显示该系统可以快速完成EDCs的完全降解，且在室温条件下的酸性环境即可以发生，不需要金属离子和其它辅助因子的帮助。用稳定性同位素C13标记的BPA和NP作为底物，检测到了7种BPA降解的中间产物和10种NP降解的中间产物。在最终的降解产物中检测到了降解产生的13CO2。经用秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)进行的生物测定结果表明，该系统可完全消除EDCs降解产物的雌激素活性。此外，经过简单的重培养，该系统可在完成上次降解作用后恢复活性。 3.研究构建了一株表面展示多铜氧化酶WlacD的重组大肠杆菌MB275。通过Western Blot、免疫荧光显微镜观察和流式细胞仪证实WlacD被锚定在细胞表面。通过3个串联重复的InaQ-N锚定单元增强使WlacD在细胞表面的锚定。通过IPTG的低浓度诱导，MB275具有较高的全细胞漆酶酶活，最高酶活可达32.7U/mL。将MB275直接吸附在裸玻碳电极上构建成一种新的酚类检测生物传感器。在最适条件下分别测定MB275对邻苯二酚、咖啡酸、多巴胺和没食子酸的响应电流，结果显示新的生物传感器的响应信号与检测物浓度在5.0μM到500.0μM的检测范围内具有良好的线性关系;对测试酚类物质的检测限为1.0μM到2.0μM，与纯酶经化学修饰后构建的生物传感器相当。低浓度的金属离子、蛋白质、糖类物质和检测物结构类似物菌对所购建的生物传感器的检测精度和准确度无明显影响。本实验所构建的新型生物传感器具有良好的稳定性和可重复利用性。在用于检测实际样品的检测试验中，发现该传感器可有效地检测出红酒、茶、尿液和废水中的酚类化合物。这种将表面展示多铜氧化酶的重组菌直接吸附在裸电极上所购建的生物传感器具有酶活高、制备简单、可重复利用和无需糖基化修饰等多重优良性能。