[背景及目的]肝脏是人体内血流极为丰富的器官之一,也承载着解毒、消化及分泌功能,因此肝脏极易受到各种因素损伤,如嗜肝细胞病毒、淤积胆汁、酒精、某些药物、细菌、寄生虫感染、代谢性疾病、自身免疫性疾病等等。肝纤维化(hepatic fibrosis)是各种急慢性肝病慢性迁延转归的中间环节,是机体对慢性肝损伤的一种修复反应,是慢性肝病的共有病理变化,其病生基础是肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)活化,合成分泌大量的细胞外基质(extracellular matrix, ECM),破坏了正常肝小叶结构。血吸虫病是热带、亚热带发展中国家的重要寄生虫病之一。我国曾是日本血吸虫病流行最严重的国家之一,尽管目前通过有效的药物(吡喹酮)控制了流行范围,但我国长江流域及其南部的7个省(市、区)仍受血吸虫感染的威胁。慢性血吸虫病对机体造成的损害以血吸虫病肝纤维化最为突出。血吸虫虫卵沉积于肝脏门脉系统并分泌可溶性虫卵抗原,激活HSCs,大量ECM沉积,最终发展为血吸虫病肝纤维化。由于肝纤维化病理过程的进展,在晚期往往表现为肝脏质地变硬,失代偿期还伴有脾脏肿大,门脉高压腹水形成。参与肝纤维化形成的始动因素主要是肝细胞坏死,炎细胞聚集,参与的细胞主要包括窦内皮细胞、枯否细胞、肝细胞以及HSCs(又称贮脂细胞)。其中心环节是HSCs在各种介导因子如转化生长因子(Transforming growth factor-β1, TGF-β1)、血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor, PDGF)以及表皮生长因子(Epidermal Growth Factor, EGF)等,最终结果导致ECM合成与降解失衡,ECM大量沉积,肝纤维化形成。在对肝纤维化机制的研究中,以始动因素HSCs的活化为重点,分别从HSCs增殖、迁移、细胞因子的分泌以及ECM的合成与降解等方面进行研究。表氧化二十碳三烯酸(EpoxyeicosatrienoicAcids, EETs)是花生四烯酸(ArachidonicAcid, AA)经细胞色素P450(Cytochrome P450, CYP450)表氧化酶代谢途径产生的生物活性物质。AA是生物体内多种重要的心血管活性物质的前体,其主要以酯化形式存在于细胞膜的内表面,在脂解激素作用下由磷脂酶A2水解释放至细胞浆内。现今已对AA研究多年,对下游的环氧化酶和脂质氧化酶代谢途径的研究较为多见,近年来有学者发现AA还可通过细胞色素P450途径代谢(即AA代谢的第三条途径),经表氧化酶代谢产生四种EETs (5,6-,8,9-,11,12-和14,15-EET)。EETs降解主要由可溶性表氧化水解酶(soluble epoxide hydrolase, sEH)控制,可生成相对应的具有弱生物活性的二羟基-20碳三烯酸(Dihydroxyeicosatrienoic acids, DHET)。多项实验证实,可通过抑制sEH酶的活性显著增加EETs的体内含量,延长其生物学作用。表氧化酶代谢途径产物EETs,最初在心血管及肾脏系统中被广泛研究,并发现EETs具有舒张血管、抑制血小板的聚集、抑制血管平滑肌细胞的炎症反应及平滑肌细胞的迁移、增强纤维蛋白溶解,以及促进内皮细胞增殖与新生血管形成等作用。EETs的生物学作用涉及面广,作用多样,对不同组织来源的细胞,生物学作用不一样,前期有研究发现,EETs可以通过抑制ERKI/2的去磷酸化和激活PI3K/AKT信号通路,减轻肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF-a)诱导的内皮细胞和心肌细胞凋亡；通过抑制核因子NF-kB的核转位,或者通过抑制NF-kB的天然抑制物IkB的磷酸化抑制炎症细胞向内皮细胞粘附,减少组织中炎症细胞浸润；通过激活cAMP-PKA途径,抑制血管平滑肌细胞迁移。基于EETs的生物学多样性,学者们逐渐将EETs与器官纤维化的发病机制联系起来,有研究表明CYP2J2表氧化酶基因及其代谢产物EETs通过抑制了巨噬细胞向心肌迁移,减少TGF-β1分泌,上调MMP-2的表达,有效地抑制了KKAy糖尿病小鼠心肌纤维化,延缓心肌重构。此外,在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中,予以sEH酶抑制剂治疗后,可明显抑制肺成纤维细胞增殖、分化及胶原合成,控制肺纤维化进展。以上研究说明EETs在心、肺等器官中具有抗纤维化的作用,虽然目前具体机制尚不明了,但为器官纤维化发病机制的研究提供了新的思路和方向。肝纤维化也是器官纤维化之一,由于反复的炎症损伤,释放趋化因子募集激活的HSCs迁移至炎症病灶,是肝脏发生纤维化的重要环节。尽管在早期的炎性损伤时,EETs具有显著的抗炎效应和抑制血管平滑肌细胞迁移的功能,但在肝纤维化的发生发展中的功能尚未明确,尤其对肝纤维化关键环节——活化HSCs的作用,尚未见报道。我们前期工作,成功建立血吸虫性肝纤维化模型,并发现肝纤维化病程中趋化HSCs迁移的因子PDGF、TGF-β1、MCP-1等表达明显上调,同时HSCs的骨架结构也发生明显改变,如运动蛋白表达上调、F-actin聚集增多,为研究EETs在血吸虫性肝纤维化中的作用,提供了良好的实验基础。因此,我们提出假设：EETs可通过抑制慢性炎症损伤、阻止HSCs活化迁移,从而改善血吸虫病纤维化。我们拟在建立血吸虫性肝纤维化小鼠动物模型基础上,对病程中肝脏EETs的含量及下游sEH进行检测分析；之后,采用sEH酶特异性抑制剂TPPU处理小鼠,内源性增加EETs含量,观察肝纤维化病程进展并探索相关机制。在体外,观察EETs对PDGF诱导的LX-2细胞活化迁移的影响,进一步论证体内相关机制,以期为肝纤维化的发病机制和治疗提供新的理论依据和策略。具体实验目的如下：1.以血吸虫性肝纤维化动物模型为研究对象：1).研究血吸虫性肝纤维化病程中EETs (11,12-,14,15-)在肝脏组织中含量的变化,及下游代谢酶sEH在病程中的动态改变,初步确定EETs在肝纤维化中的生物学效应。2).采用sEH酶特异性抑制剂TPPU内源性增加血吸虫性肝纤维化小鼠体内EETs含量,进一步探讨EETs与血吸虫性肝纤维化病程的关系及其相关分子机制。2.以PDGF诱导LX-2细胞迁移模型为研究对象：1).在动物模型试验数据的基础上,详细探讨EETs各同分异构体的作用差异,以及作用肝纤维化发病机制的具体环节。2).在明确了具体环节基础之上,进一步探讨其可能的信号分子途径。[方法]1.实验动物操作程序按照NIH实验动物管理与使用指南进行,以及以中国科学院实验动物管理规范所制定的标准进行。1).6周龄SPF级balb/c小鼠16只,体重20-23g,适应性喂养一周后,随机分为两组：对照组(8只)和感染组(8只)。感染组用购自岳阳市血防所的血吸虫尾蚴经皮肤感染小鼠(22±1条/只),感染后观察12w。具体实验方法如下：提前1h,将钉螺放入清水中,待尾蚴游出。小鼠以1%戊巴比妥进行腹腔注射麻醉,然后将小鼠固定于无菌操作台上,腹部朝上,于下腹部备皮约lcmxlcm大小,做好相应防护工作。取疫水两滴至盖玻片上,随即于显微镜下观察并对尾蚴进行计数,此后,将盖玻片有疫水一侧盖在小鼠备皮处,计时15min。然后取下玻片,待小鼠清醒,整个过程将小鼠置于温室中完成。对照组处理过程一样,仅将疫水换用生理盐水代替。所有小鼠在感染4周时,予以吡喹酮250mg/kg连续灌胃3d,以驱虫治疗。感染后12w,实验结束处理小鼠,留取肝脏标本并摄片,留取相应的血液及组织标本备用。2).6周龄SPF级balb/c小鼠48只,体重20-23克,适应性喂养一周后,随机分为6组：8w control(8只)、8w infected(8只)、8w sEHi-treated(8只)、12w control(8只)、12winfected(8只)、12w sEHi-treated(8只)。infected和sEHi-treated建立血吸虫感染模型如上所述,此外,sEHi-treated组小鼠在感染血吸虫尾蚴后第6w,用sEH特异性抑制剂TPPU进行干预。具体方法如下：TPPU每日予以小鼠灌胃,按2.5mg/kg/day体重进行,每日灌胃量约0.2ml,将TPPU溶于生理盐水中,并加以聚乙二醇400(PEG400)作为助溶剂和稳定剂。同时infected组予以同等体积的生理盐水和PEG400混合液同时灌胃处理,每日拟定于早10点进行。于感染的第8w和12w分别处理小鼠,收集标本并留取照片记录,相应的血液及组织标本留取备用。2.各组小鼠处理前,称取体重并做好记录,处理后,分别取肝脾组织测量最长直径并称取重量,血液标本离心取上清进行生化指标(ALT、AST)检测。3.称取各组小鼠取冰冻肝组织100mg用组织裂解液裂解后取上清,用ELISA方法分别检测酸化前和酸化后11,12-/14,15-DHET含量,两者的差值为组织中EET的浓度,并分析11,12/14,15-EET和sEH的表达。4.各组小鼠肝组织石蜡切片行HE染色、Masson染色以观察肝脏组织结构变化,胶原沉积情况和分布。5.部分小鼠肝组织冰冻切片行a-SMA, Fascin运动蛋白荧光共聚焦染色。6.检测小鼠肝组织中HSCs活化相关指标和内源性增加EETs对HSCs活化的影响：real-time PCR检测HSCs活化标志物(a-SMA、Desmin、Vimentin),HSCs迁移能力及细胞骨架改变(Fascin、Dynein、Dynactin),胶原合成和降解平衡(collagenI、collagen Ⅲ、 MMP-9、TIMP-1); Western-blot检测-SMA和Fascin蛋白表达水平；ELISA方法检测影响HSCs迁移的MCP-1、ICAM-1表达水平。7.体外建立由PDGF诱导的LX-2细胞迁移系统。用仅含4%胎牛血清的DMEM(高糖培养基)培养LX-2细胞,将培养瓶水平置于37℃,含5%CO2的培养箱中。当细胞呈指数增长,单层细胞大约80%汇合时,弃掉培养基,无菌PBS清洗一次。再改用含0.1%胎牛血清的DMEM培养饥饿过夜,次日用0.25%胰蛋白酶消化传代至Transwell小室,每孔细胞数4×103。在小室下方加入适量的含0.1%胎牛血清的DMEM,并向液体中加入终浓度为lOng/ml的人源性PDGF细胞因子。8.观察EETs对PDGF诱导的LX-2细胞迁移的影响时,细胞在传代至Transwell小室后,先用EETs (四种同分异构体)1uM或者LY294002预先处理细胞30min,再如上所述加入PDGF细胞因子,分别于12h、24h进行细胞计数。9. Real-time PCR检测处理后LX-2细胞a-SMA、Desmin、Vimentin、collagenI、collagen Ⅲ、Fascin的表达；Western-blot检测a-SMA、Fascin、PI3k/Akt磷酸化；免疫共聚焦检测细胞骨架微丝蛋白、Fascin、a-SMA蛋白的表达情况。[结果]1.成功建立血吸虫并肝纤维化小鼠模型,12w时肝组织HE染色显示感染组小鼠肝组织汇管区周围肝细胞胞浆疏松,羽毛状变性,伴有点状坏死或嗜酸性坏死,汇管区可见炎性细胞浸润及虫卵肉芽肿形成,胶原纤维分布于虫卵肉芽肿及汇管区周围。Masson染色显示感染组小鼠肝组织中有大量胶原纤维沉积。2. ELISA检测肝组织中11,12-/14,15-EET的含量,11,12-EET在感染组肝组织(43.69±9.07pg/ug protein)中较对照组(79.67±7.05pg/ug protein)明显减少(P<0.05),14,15-EET在感染组(9.54±1.70pg/ug protein)的浓度比对照组(14.34±1.97pg/ug protein)的浓度低,但无统计学差异(P>0.05)。用EET与DHET的比值间接反映sEH酶的活性,11,12-EET/11,12-DHET或者14,15-EET/14,15-DHET的比值与sEH酶活性呈反比,感染组中sEH酶活性均明显增高(P<0.05)。3.血吸虫病肝纤维化小鼠经sEH抑制剂TPPU干预处理后,组织大体观及形态学改变测定如下：肝脾整体取材后观察：control组肝脏色泽红润,表面光滑,脾脏色红,边缘锐利；infected组肝脏呈墨绿色,明显胆汁淤积,表面可见似肉芽肿乳白色斑点,质地较硬,脾脏肿大,色深,边缘变钝；sEHi-treated组肝脏暗红色,质地较control组硬,脾脏大小介于control组与sEHi-treated组之间。对比肝(脾)/体重指数发现12w时sEHi-treated组的肝指数(0.068±0.008)、脾指数(0.009±0.001)较infected组中肝指数(0.096±0.007)、脾指数(0.015±0.002)明显下降(P<0.05)。进行肝组织HE染色后行虫卵肉芽肿直径测定得出,sEHi-treated组肉芽肿直径在8w(0.44±0.03cm)和12w (0.61±0.04cm)时较infected组8w (0.71±0.04cm)、12w (0.73±0.04cm)明显缩小(P<0.05),而Masson染色后分析胶原面积百分比,sEHi-treated组在8w(21.77±7.87%)和12w(30.25±8.06%)时较infected组(24.83±6.35%)、(45.20±10.49%)有所减少,但无统计学差异(P>0.05)。4.经TPPU灌胃处理后,取小鼠肝脏匀浆裂解后提取上清,ELISA法分别检测肝组织中酸化前和酸化后的11,12-/14,15-DHET含量,经计算得出干预组中8w时11,12-EET (83.30±12.66pg/ug protein)及12w时(79.02±20.55pg/ug protein)较infected组(29.51±5.36pg/ug protein)明显升高(P<0.05);14,15-EET在干预组中8w时(32.63±6.38pg/ug protein),12w时(32.83±7.22pg/ug protein)较infected组(14.27±1.969pg/ug protein)亦明显升高(P<0.05)。5.实时荧光定量PCR结果显示,在感染12w时,HSCs活化相关基因a-SMA、Desmin和Vimentin在sEHi-treated组中的表达较infected组明显下调(P<0.05),同时collagen ImRNA在sEHi-treated组中的表达亦较infected组减少(P<0.05)；与胶原降解平衡关系密切的酶类,TIMP-1在sEHi-treated组中表达明显减少(P<0.05),有利于胶原的降解,而MMP-9的表达在两组间无明显差异(P>0.05),说明内源性增加的EETs对肝纤维化病程的进展有多方面的影响。6.进一步分析EETs作用的HSCs活化环节,Real-time PCR结果显示,与HSCs迁移运动相关蛋白Fascin和Dynactin的表达在sEHi-treated组中较infected组中明显下调(P<0.05),胞浆动力蛋白Dynein于感染12w时,在sEHi-treated组中亦有下调趋势,但尚无统计学差异(P>0.05)。ELISA分析影响细胞迁移的胞外因素MCP-1和ICAM的表达水平。于感染后12w时,sEHi-treated组小鼠肝组织中MCP-1的含量(138.1±15.81pg/ug protein)显著低于infected组(215.1±21.78pg/ug protein)(P<0.05),较control组(61.32±6.18pg/ug protein)仍明显升高(P<0.05); ICAM-1在小鼠肝组织中的表达与MCP-1类似,sEHi-treated组(183.4±16.43pg/ug protein)较infected组(260.1±26.46pg/ug protein)明显下降(P<0.05)。免疫共聚焦检测并定位HSCs活化标志物a-SMA(红光)和运动蛋白Fascin (绿光)的表达发现,在control组中,a-SMA几乎不表达,而Fascin仅少量表达；在infected组中,HSCs活化,a-SMA表达明显增多,同时运动蛋白Fascin表达明显增多,红绿光重合部分明显增多,说明肝纤维化时HSCs活化伴随迁移能力的增强。而在sEHi-treated组中红绿光重叠的部分较infected组中减少。Western-blot结果再次验证,在感染12w时,sEHi-treated组较infected组a-SMA和Fascin蛋白均有不同程度的下调。证明在血吸虫肝纤维化病程中,内源性增加EETs不仅抑制HSCs活化,还抑制与HSCs迁移相关动力蛋白。7.体外建立PDGF诱导LX-2细胞迁移transwell模型,分别用四种EET同分异构体(5,6-；8,9-；11,12-和14,15-EET) luM的浓度预处理细胞20min。观察四种同分异构体对PDGF诱导LX-2细胞迁移的作用发现,在加入PDGF (10ng/ml)12h时,11,12-EET组发生迁移的细胞倍数与PDGF组相比明显减少,具有统计学差异(P<0.05),同时明显高于与对照组和DMSO组(P<0.05)；在24h时进行计数发现,11,12-EET和14,15-EET组较PDGF组细胞迁移倍数明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05),同时亦高于对照组和DMSO组(P<0.05)；5,6-和8,9-EET组无论在12h还是24h,细胞迁移倍数明显高于对照组和DMSO组(P<0.05),但较PDGF组无显著性差异(P>0.05)。随后,分别观察11,12-EET和14,15-EET在不同时间点对PDGF诱导的LX-2细胞迁移的影响。结晶紫染色计数后分析发现,2h和6h时EET组细胞迁移倍数虽有下降,但无统计学差异(P>0.05),12h和24h结果如上所述,48h时EET组与PDGF组间亦无统计学差异(P>0.05)。Transwell结果表明,11,12-与14,15-EET具有抑制PDGF诱导LX-2细胞迁移的作用,其中11,12-EET抑制作用最为明显。8. Western-blot检测PDGF刺激5min、10min、30min以及60min时LX-2细胞中Akt和p-Akt的表达水平,结果发现经PDGF刺激后,p-Akt的表达明显增加,而经11,12-EET预处理的细胞中p-Akt的表达较单纯PDGF组减少,说明11,12-EET抑制了PDGF诱导的Akt磷酸化。进一步观察PI3K-Akt信号通路对细胞迁移的影响发现,11,12-EET与LY249002(P13K抑制剂,10uM)具有相似的作用,二者在PDGF刺激LX-2细胞12h和24h时可明显抑制细胞迁移(P<0.05),而11,12-DHET组细胞迁移倍数与PDGF组间无统计学差异(P>0.05)。9. Real-time PCR检测细胞模型中a-SMA以及Fascin表达水平,结果提示11,12-EET组与LY249002组较PDGF组a-SMA、Fascin的表达明显下调,提示11,12-EET可能通过抑制PI3K-Akt信号通路磷酸化,影响LX-2细胞的活化迁移能力。同时,免疫共聚焦检测LX-2细胞微丝蛋白F-actin(绿光)和运动蛋白Fascin (红光)的表达发现,微丝蛋白F-actin在PDGF组及11,12-DHET组中多聚集于LX-2细胞胞浆,且Fascin在胞浆和远端突触表达明显,但在11,12-EET组和LY249002组中,F-actin多散在胞浆中,少聚集,突触部分亦未见明显聚集,Fascin蛋白表达明显减少且多集中于胞浆中。用Western-blot检测a-SMA和Fascin蛋白的表达显示,在11,12-EET组及LY249002组中a-SMA和Fascin蛋白表达水平较PDGF组和11,12-DHET组明显下调。[统计学分析]用SPSS13.0软件进行统计学分析,所有数据均以均数±标准误表示,各分组组间差异采用单因素方差分析(ANOVA),以P<0.05为差异具有统计学意义。[结论]1.在血吸虫病肝纤维化病程中,11,12-EET和14,15-EET在肝组织中的含量存在动态变化过程,说明EETs参与了肝纤维化病程的进展,随着纤维化的发生发展,EETs在肝组织中的含量有所下降,与其下游代谢酶sEH的活性增加密切相关。2.通过每日予以血吸虫病肝纤维化小鼠口服sEH酶抑制剂TPPU,可内源性增加肝脏内11,12-和14,15-EET的含量。3.在感染血吸虫尾蚴12w(予以TPPU灌胃治疗6w)时,EETs的增加可明显改善肝脏、脾脏的组织形态学,显著抑制血吸虫虫卵肉芽肿大小,减轻虫卵周围炎症反应,降低肝脾指数,延缓血吸虫病肝纤维化的进展。4.EETs延缓血吸虫病程进展的分子机制可能通过抑制了HSCs活化、迁移,抑制胶原的合成分泌,增加胶原的降解等实现,包括抑制HSC活化标志物(a-SMA、Vimentin)的表达、抑制HSC自身运动相关蛋白(Fascin、Dynactin)的表达、下调诱导HSC迁移因子(MCP-1、ICAM)的表达,抑制collagenl表达和下调TIMP-1表达等。5.外源性加入四种EETs同分异构体观察对PDGF诱导的LX-2细胞迁移的影响,其中11,12-EET和14,15-EET具有抑制迁移效应,主要表现在下调LX-2细胞自身运动蛋白的表达,其可能时通过抑制PDGF诱导的PI3K-Akt信号通路磷酸化实现。6.本实验所取得的研究结果丰富了肝纤维化发病机制的研究思路和内容,拓展了EETs的生物学效应,为将来肝纤维化的治疗提供了新的策略,为药物开发和生物学功能检测提供了新的理论依据和研究方向。总结：EETs通过抑制HSC活化、迁移,减少胶原合成,增加胶原降解等缓解了血吸虫性肝纤维化病程的进展,11,12-EET部分通过抑制PI3K-Akt磷酸化降低了PDGF对LX-2细胞的迁移诱导能力。