论文部分内容阅读
MGC13096是一功能完全未知的假设蛋白,它包含了一个PDCD2_C结构域。这个结构域同时也存在于PDCD2(Programmedcelldeath2)蛋白中。GO(Geneontology,基因功能分类体系)认为PDCD2和MGC13096都具有凋亡调节活性,参与凋亡过程。有文献对PDCD2是个凋亡相关蛋白提出了置疑。
通过对PDCD2的生物信息学分析表明:PDCD2在胸腺、淋巴结高表达;上游非翻译区有Elk-1,HEN1,HIC-1,HES-1,AP4,CDE/CHR等分化、增殖相关的转录因子结合;在生长、分化、感染类的基因表达谱中有较多的显著差异。而MGC13096则在结肠、肺、子宫颈、胃、肠等高表达;只发现在胰岛素抗性病人的基因表达谱中表达显著加强。
序列研究表明:在HEK293T、胃癌AGS细胞中PDCD2的两个转录本编码区与Genbank中的序列(NM_002598、NM_144781)相比均少了一段99bp的序列,Genbank接收号为:AY948416、AY948417。测序证实HEK239T、肝癌HepG2细胞中MGC13096的编码区序列与Genbank中的编码区序列(NM_032346)完全一致。
用无血清、2%乙醇、4%乙醇、4%DMSO、8%DMSO等刺激HEK293T细胞发生凋亡的情况下,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,用荧光定量PCR方法分析MGC13096、PDCD2的基因表达情况。无血清、2%乙醇刺激下DNA发生泄漏的凋亡细胞数没有显著变化,其它三种刺激均有显著变化。PDCD2只在2%乙醇刺激下表达明显上调。MGC13096基因表达在五种凋亡处理后无论凋亡细胞的多少均没有显著增多。这些数据表明PDCD2和MGC13096与凋亡可能不是广泛相关。
将MGC13096的完全编码区连入真核表达载体pcDNA3.1,转染HEK293T细胞,得到MGC13096过表达的细胞克隆B12,转染空载体的细胞克隆为H5。B12细胞生长变缓,细胞周期阻滞在S期而没有发生DNAladder,没有出现sub-G0峰。由此认为MGC13096基因表达产物引起细胞生长变缓是因为细胞周期阻滞在S期而不是细胞凋亡引起的。
接着,用双荧光素酶法对MGC13096抑制生长的机理做了深入探索。MGC13096对STAT1、CRE、NFAT、NFκB、AP1五种细胞通路影响不一。MGC13096促进STAT1通路的活化,抑制CRE,NFAT,NFkB,AP1通路的活化。其中NFκB、AP1的活化抑制得最多。可能MGC13096通过NFκB和AP1调控了很多与生长相关的基因导致细胞生长变缓。
与MGC13096有着同样PDCD2_Cdomain的PDCD2可能与凋亡不是广泛相关,在凋亡细胞中MGC13096没有显著上调,过表达MGC13096的细胞凋亡不显著,由此MGC13096很可能与凋亡没有直接关系。我们对MGC13096的相互作用蛋白做了研究,期待从相互作用蛋白的角度分析MGC13096的可能功能。
LC-MS-MS鉴定了12种用His6-Pulldown方法得到的MGC13096相互作用蛋白。它们是:HypotheticalMGC13096,Programmedcelldeath2isoform1,B-cellreceptor-associatedprotein31,26Sproteasomenon-ATPaseregulatorysubunit8,Elongationfactor1-alpha1,Poly(rC)-bindingprotein1/2/3,LactatedehydrogenaseA,L-lactatedehydrogenaseB,Isocitratedehydrogenase3betasubunitisoformaprecursor,NipSnaphomolog1,Prohibitin,Prohibitin2。MGC13096分别与它本身、PDCD2isoform1相互作用,说明它可能是以MGC13096蛋白聚合物或MGC13096与PDCD2的聚合物形式发挥功能的。而这种聚合物的形成很可能靠的就是PDCD2_Cdomain之间的聚合。MGC13096与两个参与葡萄糖代谢的蛋白相互作用:一是乳糖脱氢酶(LDH),包括LDHA4,LDHB4和/或它们的三种杂合体。另一个是异柠檬酸脱氢酶(IDH)3β亚基a异构体前体。这说明MGC13096可能通过LDH和DH参与了葡萄糖代谢。另外,MGC13096还与执行蛋白翻译、转运、降解的蛋白相互作用。延伸因子1-alpha1促进蛋白质生物合成中GTP依赖的氨酰-tRNA结合到核糖体的A位点,促进蛋白质延伸。Poly(rC)-结合蛋白1,2,3参与调节mRNA稳定,促进翻译。B-细胞受体相关蛋白31参与内质网和高尔基体之间的蛋白运输。26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基8参与蛋白质的降解。这些说明它广泛参与了蛋白代谢。难怪它在胰岛素抗性病人的基因表达谱中表达显著加强了。
由以上数据可见:MGC13096可能是一个与葡萄糖、乳糖等糖类以及蛋白质代谢相关的蛋白。