恶性肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因,约占肿瘤相关致死的90%以上。肿瘤细胞的迁移能力对于肿瘤细胞成功实现远端转移至关重要,而肿瘤迁移能力的获得与癌基因变化密切相关。CD147（Cluster of differentiation 147）,属于免疫球蛋白超家族,是一种被高度糖基化的跨膜蛋白。CD147在多种组织和细胞中广泛表达,特别是在多种恶性肿瘤组织和细胞系中高表达,并参与肿瘤细胞的黏附和转移。目前的研究认为,细胞伪足的形成是细胞运动的必要条件,其中,丝状伪足是一种类似于手指状的质膜结构,能够为细胞提供粘附位点,使细胞粘附于细胞外基质并产生净力以驱动细胞运动。然而作为细胞跨膜蛋白的CD147分子如何传导下游信号,特别是如何参与伪足形成的关联信号还完全不清楚。Cdc42的活化是细胞伪足形成信号的胞内始动环节。Cdc42是Rho GTPase超家族的一员,属于结合GTP活化和结合GDP失活的开关蛋白。Cdc42能够通过依赖肌动蛋白相关蛋白2/3（actin-related protein-2/3,Arp2/3）复合物的“收敛延伸”模式和不依赖Arp2/3复合物的“尖端核化模式”两种不同的机制来促进细胞形成丝状伪足,从而调控丝状伪足的形成,参与肿瘤细胞的迁移和转移过程。CD147作为在肿瘤中高表达的跨膜蛋白,是否能够与细胞内的Cdc42相互作用,并调控Cdc42的活化,启动细胞伪足的形成过程,也完全未见报道。为此,本项目系统地研究了细胞膜蛋白CD147与细胞伪足形成信号始动蛋白Cdc42的相互作用,探讨了CD147对Cdc42的活化和对细胞伪足形成的调节,并揭示了CD147活化Cdc42信号的功能域和相关联的磷酸化位点,探究了CD147影响肿瘤细胞迁移的关键结构基础。在此基础上,我们制备了特异性的CD147磷酸化抗体,在细胞和组织水平上检测了CD147磷酸化与肿瘤恶性度的关联,以提供一条CD147促进肿瘤细胞迁移的新型信号通路的转导机制。首先,我们研究了CD147与细胞伪足形成的关系。通过过表达CD147,我们发现CD147促进前列腺癌细胞系LNcap细胞形成大量细长的伪足结构,伪足的数目和长度显著高于对照组。进一步通过免疫荧光染色证明了CD147的过表达促进细胞膜周围的伪足标志物Fascin1（定位于整个丝状伪足）和mDia2（定位于伪足的尖端）的表达增多,说明CD147的过表达诱导了丝状伪足产生。同时,通过Transwell实验,我们检测了CD147对细胞迁移能力的影响,发现过表达CD147后,迁移到高浓度血清中的细胞显著增多,证明CD147的过表达促进了伪足的形成和细胞的迁移。然后,我们检测了过表达CD147条件下对伪足信号通路关联蛋白的调控作用。我们发现,CD147的过表达促进了伪足形成上游信号Cdc42表达水平的升高,同时伴随着Cdc42信号通路下游蛋白ArpC2和N-WASP的表达增高,并显著提高了伪足标志物Fascin1和mDia2的表达水平,提示了CD147的过表达活化了伪足形成信号。Cdc42信号的GTP型具有结合到下游PAK1分子CRIB功能域的能力,通过GST-PAK1-CRIB融合蛋白的GST-pulldown实验发现,过表达CD147后,Cdc42结合GTP的活化型显著增多,提示CD147促进了Cdc42的活化。进一步,通过shRNA干涉技术,我们探究了是否Cdc42是参与CD147诱导的丝状伪足形成过程中的必要意义。我们发现,过表达CD147条件下靶向干涉Cdc42基因后,逆转了CD147对Cdc42伪足信号通路中关联蛋白的促进作用,下调了CD147诱导的ArpC2、N-WASP、Fascin1和mDia2的表达水平。在显微镜下发现,干涉Cdc42基因逆转了CD147对细胞伪足的促进作用,丝状伪足的长度、数目接近于对照组。Transwell实验也证明Cdc42的下调逆转了CD147对细胞迁移的促进作用。这些结果提示Cdc42参与了CD147诱导的丝状伪足形成和细胞迁移。CD147作为免疫球蛋白超家族的一个跨膜糖蛋白,其分子结构中的大部分都位于胞外,其胞内仅含有一个39个氨基酸的胞内尾;而Cdc42主要定位于质膜下和高尔基体^[1],这也为Cdc42能够与CD147发生相互作用提供了前提条件。我们进一步检测了两者的相互作用,探讨了CD147胞内域对Cdc42识别的可能性。免疫荧光实验证明,在肿瘤细胞中,CD147能够与Cdc42共定位于细胞内,CO-IP实验表明,免疫沉降内源性CD147蛋白,能够免疫共沉降到内源性的Cdc42;免疫沉降过表达的CD147蛋白,也能够免疫共沉降到内源性的Cdc42;证明CD147与Cdc42存在于同一复合物中。通过GST-pulldown实验,我们检测到CD147胞内域与Cdc42的直接作用。以上结果证明CD147胞内域与Cdc42存在着直接的生物物理学相互作用,为CD147活化Cdc42提供了结构基础。CD147的胞内域含有S246和S252两个丝氨酸磷酸化位点,蛋白质的磷酸化修饰是开启蛋白活性的重要方式,我们进一步研究了参与CD147促进细胞迁移和伪足形成功能相关的磷酸化位点。我们比较了CD147野生型和磷酸化位点突变型CD147（S246A）、CD147（S252A）以及CD147（S246/252A）的功能,发现S246A与野生型CD147的伪足形成功能类似,而S252A和S246/252A磷酸化突变强烈的抑制了丝状伪足的形成,提示了S252位点突变改变了野生型CD147对伪足的诱导作用,提示了S252位点的磷酸化是CD147促进伪足形成的关键环节。通过GST--pulldown实验,我们检测到S252A磷酸化突变的CD147胞内域失去了与Cdc42的直接作用,提示S252位点的磷酸化是开启CD147识别Cdc42的关键信号。在证明CD147的S252磷酸化修饰位点在CD147诱导丝状伪足形成和促进细胞迁移过程中起决定性作用的基础上,我们制备了S252位点的CD147磷酸化抗体,并检测了正常细胞,低恶性度肿瘤细胞和转移性高恶性度肿瘤细胞之间CD147蛋白S252磷酸化的差别,发现正常细胞和低恶性度肿瘤细胞难以检测到CD147蛋白S252的磷酸化,而转移性高恶性度肿瘤细胞可以检测到显著的S252磷酸化的CD147蛋白。随着肿瘤恶性化程度的增强,Cdc42的活化水平也显著增强,提示CD147的S252磷酸化与肿瘤转移能力和Cdc42的活化有关。通过临床样本,我们也发现了同样的趋势。这些结果说明,CD147的磷酸化决定了Cdc42的活化水平,进而决定了肿瘤的恶性化程度。综上所述,我们的研究发现CD147不仅促进了Cdc42的表达,而且通过胞内域直接激活了Cdc42信号,诱导了丝状伪足的形成,进而促进了细胞的迁移。CD147胞内域252位丝氨酸的磷酸化激活直接参与了CD147/Cdc42伪足信号的开启。我们的研究结果为以CD147为靶向的肿瘤抗转移提供了新型信号转导途径,为相关肿瘤治疗提供了新的思路和策略。