脑卒中作为缺血性脑血管病,其发病迅速,治疗窗口期短,还可能会造成患者行为能力丧失甚至死亡,严重危害人类健康。溶栓治疗在脑卒中急性期占主导地位,然而随着血管复通,血流恢复,产生了更为严重的“缺血再灌注损伤”。由于脑缺血再灌注损伤是多分子、多机制相互影响的病理生理过程,寻找积极有效的治疗方案具有重要意义。现代药理学研究显示,中药多成分、多靶点的特性在防治心脑血管疾病方面具有显著优势。心脑宁胶囊由银杏叶、小叶黄杨、丹参、大果木姜子、薤白配伍而成,对心血管疾病具有良好的临床疗效,但在脑血管疾病领域研究较少,相关机制研究几乎是一片空白。因此探究复方中药心脑宁胶囊对脑缺血再灌注损伤的保护作用,挖掘其作用机制具有一定的研究意义。目的:本论文选取心脑宁胶囊(XNN)作为研究对象,分别从行为学、影像学以及组织病理学对小鼠脑缺血再灌注模型进行评估,旨在探究其对急性脑缺血再灌注损伤的保护作用。通过网络药理学分析心脑宁胶囊治疗缺血性卒中的重要靶点以及相关机制通路。从动物水平到分子水平系统地探究心脑宁胶囊改善脑缺血再灌注损伤的作用机制,为其用于临床缺血性卒中的治疗提供理论依据和实验参考。方法:本研究选用雄性ICR小鼠作为实验对象,在诱导缺血再灌注损伤之前采取预给药的形式处理。心脑宁胶囊组每日按3g/kg灌胃XNN内容物混悬液;阳性药组每日按9mg/kg尾静脉注射依达拉奉(YDLF);模型组以及假手术组每日灌胃生理盐水,持续7天。采用线栓闭塞大脑中动脉的方式建立小鼠脑缺血/再灌注损伤模型。选择缺血时间为30min,再灌注时间为24小时。即相关数据的检测,组织的取材,均在缺血再灌注24小时左右进行。首先从动物整体水平出发,采用Bederson神经行为学评分,在造模苏醒后立即进行神经功能评价。排除掉未造成缺血损伤(0分)或者损伤过重(5分)的样本,使入组小鼠神经功能损伤尽可能处于同一水平。在缺血灌注24h再进行神经行为学评分,评价神经功能损伤进展情况。后续利用小动物活体成像设备Micro-CT结合X线对比剂碘海醇注射液进行扫描,再通过三维重建技术重现各组小鼠脑中线,计算偏移量,判断脑水肿情况;利用TTC染色法评价小鼠脑梗死面积改善情况。再灌注24小时取脑组织并切片,进行TTC染色并拍照,计算梗死面积并统计梗死百分比;利用H&E染色技术评价各组小鼠缺血再灌注损伤后纹状体和海马区组织病理学差异。完成药效学评价之后,为了探寻心脑宁胶囊对脑缺血再灌注损伤最主要的作用机制,我们运用网络药理学IPA分析,将XNN主要活性成分与缺血性卒中相关靶点相结合,得到化合物-靶点-通路相关数据,分析出其最有可能的作用通路,以及该通路上的关键靶点,并以此为切入点进行机制探究与验证。我们利用免疫印迹法测定了小鼠脑组织NF-κB p65总蛋白的表达;借助免疫组织化学染色法,分析并评价了NF-κB p65蛋白在脑组织细胞核中的表达情况;最后我们利用RT-PCR技术,检测各组NF-κB通路下游相关炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-αm RNA水平。完成了基于炎性反应的XNN抗脑缺血再灌注损伤的机制探究。结果:在模型的建立与评价方面,各手术组与假手术组之间表现出显著性差异,且各手术组之间无显著性差异,表明手术均成功诱导缺血损伤,平行性较好。在24h时,XNN组和YDLF组神经行为学评分均显著低于模型组(p<0.01)。Micro-CT影像结果显示,心脑宁组与YDLF组脑中线偏移距离均显著小于模型组(p<0.01)。在组织病理学评价方面,TTC染色结果显示,XNN组梗死面积显著小于模型组(p<0.01),YDLF效果更为明显(p<0.001);HE结果显示,XNN组及YDLF组相较模型组细胞分布与排列更为规整,染色较为正常,有一定的细胞间质水肿现象。网络药理学分析显示,XNN干预脑缺血再灌注损伤最有可能通过神经炎症信号通路发挥作用,且最终的核心靶点分析显示与Rel A(p65)相关性最高。蛋白免疫印迹结果显示,XNN组NF-κB p65总蛋白的含量较模型组显著降低(p<0.001);免疫组织化学染色结果显示,模型组细胞核存在大量NF-κB p65阳性表达,XNN组阳性细胞数较模型组有显著性差异(p<0.01),但若采用积分光密度测量法,与模型组之间的差距更为显著(p<0.001);RT-PCR结果显示,XNN组NF-κB下游相关的炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-αm RNA的水平较模型组均有一定的下降趋势,其中IL-1β最为明显(p<0.05)。结论:本研究发现XNN对脑缺血再灌注损伤有保护作用。其能够改善MCAO模型损伤后的神经功能障碍;可以保护血脑屏障,抑制继发性脑组织水肿的进展;能够挽救缺血半暗带,减小脑梗塞病灶的范围;能够改善病理所呈现的组织及细胞损伤;能够抑制脑缺血再灌注损伤后NF-κB p65的表达,减少其下游相关炎症因子m RNA的水平。相关网络药理学分析结果也互相验证了这一点。由此我们推断,XNN能够通过下调NF-κB及其通路相关炎症因子的表达发挥抗脑缺血/再灌注损伤的作用。