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研究背景:感染性休克是指感染病原微生物所导致的休克,为临床上时常发生的休克形式,主要表现为血压降低,身体组织器官低灌注状态,进而导致缺血坏死,病情十分凶险,死亡率非常高(约为60%),虽然目前临床上采用各种积极的抗休克措施或拮抗细胞因子的疗法,但效果差强人意,成为诊疗过程中亟待处理的难题。其中,革兰阴性杆菌(G-)入侵导致的败血症休克是最为多发的感染性休克类型。脂多糖(LPS)在G-菌引起的败血症休克中发挥主要作用,通过给动物注射LPS引起的类似败血症休克的表现称为内毒素休克,是我们研究感染性休克的常用模型。LPS进入体内可以激活免疫系统,大量细胞因子由巨噬细胞等免疫细胞释放,继而引起血管扩张、血管床容量增大、有效循环血量不足,最终出现内毒素休克相关症状。由此可见,巨噬细胞在内毒素休克的发病和进展过程中起到了至关重要的作用。z-VAD-FMK(zVAD)是一种泛caspase抑制剂,在许多细胞类型中可以诱导程序性坏死,并且zVAD在LPS介导的内毒素休克模型中可以诱导程序性坏死。因此,研究zVAD对巨噬细胞的活性及数量的调控有望改善和治愈内毒素休克。研究目的:研究zVAD对巨噬细胞极化及程序性坏死的影响机制,以及其对内毒素休克发病的影响,为内毒素休克的基础研究与临床干预提供理论基础。研究方法:1.用同等剂量的LPS(10μg/g)处理C57BL/6小鼠,在第0、3、6、12小时,断颈法处死各组小鼠。(1)qRT-PCR对小鼠外周血单核细胞(PBMCs)和脾中RIP1、RIP3和MLKL mRNA进行定量检测。(2)免疫荧光染色观察肝和肺中RIP1和RIP3蛋白水平的表达。2.提前2小时,给予小鼠腹腔注射zVAD(5,10和20μg/g),而后注射相同剂量LPS(40μg/g),观察死亡率;提前2小时经腹腔注射同一浓度的zVAD(20 μg/g),而后注射不同剂量的LPS(25,37.5和50 μg/g),观察死亡情况。3.给予小鼠腹腔注射不同浓度的zVAD(5,10和20μg/g),经过2小时,用LPS(10μg/g)腹腔注射构建内毒素休克模型。(1)H&E染色分析肝和肺的病理损害程度。(2)TUNEL检测肝肺组织中凋亡细胞比例。(3)ELISA检测血清中细胞因子TNF-α,IL-12和IL-6的浓度。(4)MPO活性检测技术检测研磨的肝肺组织中中性粒细胞浸润情况。(5)流式检测MDSCs及其分型细胞在脾脏中的比例。4.给予小鼠腹腔注射相同剂量LPS(10μg/g),1小时后腹腔注射zVAD(20 μg/g)。(1)流式检测巨噬细胞和树突状细胞活化指标CD86的表达量。(2)ELISA检测血清中TNF-α和IL-6的浓度。5.分别给予小鼠腹腔(i.p.)或尾静脉(i.v.)注射zVAD(20 μg/g),2小时后均腹腔注射LPS(10 μg/g)。(1)H&E染色分析肝和肺的病理损害程度。(2)TUNEL检测肝肺组织凋亡细胞比例。(3)ELISA检测血清中TNF-α,IL-12和IL-6的浓度。(4)流式分别测量6小时与12小时腹腔中巨噬细胞的比例和腹腔巨噬细胞中PI+细胞的比例。6.用zVAD(20μg/g)预处理小鼠2小时(i.p.或i.v.),而后用LPS(25 μg/g)处理小鼠(i.p.),观察并记录死亡情况。7.用C57BL/6小鼠来源的骨髓细胞,加GM-CSF诱导后收取骨髓来源巨噬细胞(BMDMs),用不同浓度 zVAD(20,40 和 80 μM)处理 BMDMs,CCK8检测细胞活力,确定合适的药物浓度。8.2 ml 3%巯基乙酸盐处理C57BL/6小鼠(i.p.),第3天于超净工作台收取腹腔细胞铺板,3小时后丢弃未贴壁细胞,更换新培养基,获得贴壁的腹腔巨噬细胞。(1)用不同浓度的zVAD(5,15和45 μM)处理腹腔巨噬细胞,CCK8检测细胞活力,确定合适的药物浓度。(2)zVAD(45 μM)或PBS预处理腹腔巨噬细胞,然后加LPS(100 ng/ml)刺激24 h,收腹腔巨噬细胞抽提蛋白,用Western blot检测p-RIP1的相对表达量。9.提前30 min,用不同浓度的zVAD(20,40和80μM)处理BMDMs,用不同浓度的zVAD(5,15和45 μM)处理腹腔巨噬细胞,在24 h或48 h时把细胞的培养上清分别采集起来。ELISA检测上清中TNF-α,IL-12和IL-6的浓度。10.用 zVAD(20 μg/g,i.p.)处理 C57BL/6 和 iNOS-/-小鼠,2 小时后给予 LPS(10μg/g,i.p.),构建内毒素休克模型。(1)H&E染色分析肝和肺的病理损害程度。(2)ELISA检测血清中TNF-α,IL-12和IL-6的浓度。11.取C57BL/6和iNOS--小鼠骨髓细胞,用GM-CSF(10 ng/ml)刺激,诱导获得BMDMs。(1)用不同浓度的zVAD(20,40和80μM)预处理,30 min后用LPS(100 ng/ml)刺激24小时,用流式细胞术检测PI+的BMDMs比例。(2)用zVAD(20 μM)处理,30 min后用LPS(100 ng/ml)分别刺激0,10,20或40 min,收细胞,提蛋白,用Western blot对BMDMs中p-RIP3和t-RIP3的相对含量进行检测。12.用zVAD(20 μg/g,i.p.)预处理小鼠2小时,用LPS(10 μg/g)建立内毒素休克模型。流式测量脾与肝脏中巨噬细胞膜上CD86和胞内TNF-α的表达。13.用 zVAD(80 μM)处理 BMDMs,30 min 后用 LPS(100 ng/ml)刺激 24小时。流式细胞术检测BMDMs胞内TNF-α和IL-6的表达情况。14.用zVAD(80 μM)或 PBS 处理 BMDMs,30 min 后用 LPS(100 ng/ml)分别刺激 20 min或40 min。用Western blot检测BMDMs中p-P65、P65、P38、p-P38、ERK、p-ERK、JNK和p-JNK的相对含量。结果:1.(1)在LPS诱导的内毒素休克模型中,PBMCs和脾中RIP1、RIP3和MLKL mRNA水平的表达上调。(2)肝和肺中RIP1和RIP3蛋白水平的表达上调。2.LPS诱导的内毒素休克小鼠的死亡比例由于腹腔注射zVAD而降低。3.(1)H&E结果显示zVAD可以降低LPS诱导的内毒素休克小鼠肝肺组织病理损害程度。(2)zVAD减少LPS诱导的内毒素休克小鼠肝肺组织细胞凋亡。(3)zVAD减轻LPS诱导的内毒素休克小鼠血清中TNF-α,IL-12与IL-6的浓度。(4)zVAD减少LPS诱导的内毒素休克小鼠肝和肺组织匀浆中中性粒细胞的含量。(5)zVAD增加LPS诱导的内毒素休克小鼠MDSCs及G-MDSCs的比例。4.(1)zVAD后处理对LPS诱导的内毒素休克小鼠巨噬细胞和树突状细胞CD86的表达无显著影响。(2)zVAD后处理对血清中TNF-α浓度无显著影响,有升高血清中IL-6浓度的趋势。5.(1)H&E结果显示腹腔注射zVAD可以减轻LPS诱导的内毒素休克小鼠肝肺组织损伤而静脉注射zVAD却无显著效果。(2)腹腔注射zVAD可以降低LPS诱导的内毒素休克小鼠肝肺组织中凋亡细胞的比例,而静脉注射zVAD无显著效果。(3)腹腔注射zVAD可以降低血清中TNF-α,IL-12和IL-6的浓度,而静脉注射zVAD无显著效果。(4)腹腔注射zVAD预处理后,建模第6小时和12小时,与单纯LPS处理组比较,腹腔细胞中巨噬细胞的比重显著降低,腹腔巨噬细胞中PI+细胞的比重显著提高,与此同时,静脉注射zVAD组未检测到显著差异。6.腹腔注射zVAD可以使LPS诱导的内毒素休克小鼠死亡比例大幅下降,相反,静脉注射zVAD无显著疗效。7.80 μM zVAD不会降低BMDMs的细胞活力。8.(1)45 μM不会降低腹腔巨噬细胞的细胞活力。(2)zVAD可以提高LPS刺激的腹腔巨噬细胞p-RIP1的水平。9.zVAD可以减少LPS刺激的BMDMs和腹腔巨噬细胞TNF-α,IL-12和IL-6的分泌。10.(1)H&E结果显示zVAD可以减轻WT小鼠的肝肺组织损伤,但对iNOS-/-小鼠无保护作用。(2)zVAD可以降低WT小鼠血清中TNF-α,IL-12和IL-6的水平,但是对于iNOS-/-小鼠无明显效果。11.(1)iNOS-/-小鼠来源的BMDMs PI阳性率要低于WT小鼠。(2)iNOS--小鼠BMDMs中p-RIP3/RIP3的比例要低于WT小鼠。12.zVAD(i.p.)可以减少LPS诱导的内毒素休克模型中脾与肝中巨噬细胞分泌TNF-α和表达CD86。13.zVAD预处理对LPS刺激BMDMs产生IL-6和TNF-α的水平无明显影响。14.LPS刺激BMDMs后所激活的MAPKs和NF-κB信号通路在zVAD预处理下无显著改变。结论:1.程序性坏死相关分子在内毒素休克中表达增加。2.zVAD可以缓解内毒素休克病情。3.zVAD通过介导巨噬细胞程序性坏死从而减轻炎性反应缓解内毒素休克病情。4.zVAD通过诱导MDSCs的聚集抑制巨噬细胞活化从而减轻炎性反应缓解内毒素休克病情。