生物矿化(biomeralization)是指在生物有机大分子(主要是蛋白质、糖蛋白或多糖)调控下,在生物体特定部位有序沉积形成矿物晶体(生物矿物)的过程。软体动物的贝壳则是生物矿物典型的代表。由于珍珠贝(包括海水和淡水)可分泌形成质地坚硬、色彩斑斓、熠熠生辉的文石结晶层,而被利用于培育有核或无核珍珠。合浦珠母贝Pinctada fucata martensii是中国及日本等国家最主要的海水育珠贝,其所产珍珠史称“南珠”。本研究基于合浦珠母贝全基因组序列全基因组序列精细图谱,通过检测和分析贝壳珍珠层与棱柱层的基质蛋白(家族),探讨贝壳结晶层的形成分子机制;并利用WGCNA的方法构建了贝壳蛋白在非生理条件下的应激网络。由于珍珠贝珍珠层与珍珠在物质组成、形成过程的相似性,该研究对于理解珍珠贝珍珠形成的机制及珍珠品质的改善也都有一定的借鉴意义。具体的研究结果如下:1.合浦珠母贝贝壳蛋白组学研究基于合浦珠母贝全基因组序列精细图谱,本研究利用高效液相色谱串联质谱电喷雾检测技术(LC-ESI-MS/MS)分别获得棱柱层的酸不溶蛋白(PI)、可溶性蛋白(PS)、珍珠层不溶性蛋白(NI)和可溶性蛋白(NS)各207、109、199和120种,其中有78个为已知功能的。分别计算四组蛋白中含量最高的20种蛋白,结果发现四组样品共有的高含量基质蛋白为酪氨酸酶(Tyrosinase,Tyr)、类纤连蛋白(Fibronectin-like protein,FLP)和N19。棱柱层与珍珠层基质蛋白含低复杂性区域(related low complexity domain,RLCD)蛋白,或称天然无序蛋白(intrinsically disordered proteins,IDP)。四个样品中,已报道的珍珠层基质蛋白均被检测到,但含量存在较大的差异,如N19和nacrein等。相同的情况也发生于已知棱柱层特有的蛋白,如Tyr和FLP。结晶层基质蛋白编码基因的组织表达数据显示,多个组织都存在一定的贡献率,而非传统的认识外套膜不同分区特异表达确定其结晶层特有蛋白。不同的结晶层虽然有其特有的基质蛋白,但含量较高的功能基质蛋白,一般同时存于两种结晶层,基质蛋白的水平差异可能是选择不同结晶形态的主要因素。另外,在基因组数据基础上,比较三种贝类(pinctadafucatamartensii、lottiagigantea和crassostreagigas)的贝壳基质蛋白,结果显示,单拷贝基因家族中的碳酸酐酶(carbonicanhydrase,ca)在贝壳中已经分化出新的功能基因(nacrein)。tyr家族有些成员在三个物种中都能找到同源基因,且在合浦珠母贝中为多拷贝基因,而部分成员则仅在长牡蛎中找到同源基因,说明tyr在序列上已经发生明显分化,这与贝类tyr家族进化分析的结果相吻合。多种ecm在贝壳中含量丰富,暗示ecm在贝壳矿化中起重要的作用。2.贝壳基质蛋白(家族)序列分析、同源建模与功能预测对贝壳蛋白中重要的基质蛋白(家族)tyr、flp和idps进行了序列和功能分析。分别克隆获得2个合浦珠母贝和10个长牡蛎tyr家族成员的全长。本研究主要关注合浦珠母贝和长牡蛎贝壳中的tyr成员,其序列特征以及含量分析显示,tyr的pi值可能对其在贝壳中的功能有重要的相关性。对贝类及其他物种已知的tyr家族进行进化分析,结果显示合浦珠母贝和长牡蛎tyr都单独进化成一支,进一步表明两个物种以及物种内功能可能已经发生了分化。同源建模后获得催化活性中心关键氨基酸具体的位置信息,并分析其与酶活性之间的关系。合浦珠母贝的flps序列与结构分析结果显示,含4个fniii结构域,内含氨基酸重复差异较大,二级结构显示都可形成典型的β折叠,但都缺乏重要的与细胞结合的功能结构域rgd,暗示着与细胞结合的功能的缺少。单个fniii结构域的进化分析显示,贝壳flps中fniii与高等动物的酪氨酸磷酸酯酶(proteintyrosinephosphatase,ptp)具有较高的同源性,暗示着可能存在相似的功能。合浦珠母贝贝壳中的idps在四个样品中种类以及丰度占较大的比例。在全基因组水平上,对比3个贝类物种合浦珠母贝、长牡蛎和帽贝贝壳中idps占所有贝壳基质蛋白的比例,平均比例分别为28.53%,15.55%和26.64%。发现在3个物种的特有贝壳基质蛋白含量较平均水平高,分别为34.23%、18.52%和34.62%。合浦珠母贝的多拷贝直系同源中含量也达到了33.33%,主要原因为细胞外基质(ecm)的组分较多。通过比对发现珠母贝属珍珠层和棱柱层IDPs同源性极高,如珍珠层基质蛋白MRMP34,NUSP1/2/5/7/8/9和棱柱层PUSP2/8/10。通过网上IDP比对工具,发现pearlin(N16)、nacrien和MSI60都含有鲍珍珠层特有基质蛋白AP7结晶结合位点基序DDNGN。因此推断文石晶体成核的功能基因通过成核基序(motif)维持其保守性,并以模块化形式发挥作用。3.采用共表达网络分析法(WGCNA)构建合浦珠母贝高温、酸化胁迫下的应激调控网络从NCBI网站CEO数据库中,获取在高温和海水酸化胁迫下合浦珠母贝外套膜基因表达数据。利用共表达网络分析法(WGCNA)筛选出在上述胁迫下影响显著的基因模块,并对模块中包含的基因进行功能富集;同时将贝壳蛋白在各个模块的分布情况进行统计,并分析贝壳蛋白与hub-gene的关联性,构建矿化基因的应激网络。结果表明,高温显著响应模块基因富集结果显示细胞骨架蛋白基因,如ARHGEF4、SAP和myosin都发生了显著的变化,而这些基因主要与细胞迁移关系密切。另外,该模块中受影响的信号通路基因较多,包含热激蛋白,主要受影响的基因是膜受体蛋白,说明细胞对温度应答较复杂。酸化应答模块共5个,响应的基因包括呼吸相关的血红素A合成酶、芳香族氨基酸代谢相关的酶、钙粘蛋白和血小板反应蛋白等。同时,本研究关注的矿化基因也在高温应答模块中富集,其中包括Tyr、FLP等重要的矿化基因,说明这些矿化基因对温度较为敏感。为研究这些矿化基因与其他基因的关联性,本研究构建了基因共表达网络,结果显示钙离子结合蛋白、细胞骨架蛋白、蛋白质糖基化相关的基因关系密切。在实验室模拟海洋酸化条件下,测定了3个珍珠层基质蛋白编码功能基因的表达量变化以及贝壳晶体形貌的变化,结果显示这些基因的表达受不同程度的影响,珍珠层也出现非正常晶体形貌特征。