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实验目的: 研究BMP9诱导干细胞成骨分化中活化PI3K/Akt信号通路与环氧酶-2的关系。 实验方法: 主要采用ALP染色及活性测定、Western blot检测、茜素红染色以及免疫荧光等技术,研究BMP9诱导干细胞成骨分化中激活PI3K/Akt信号通路的可能机制。具体方法如下: 1.分别采用ALP染色或活性检测、茜素红染色法检测BMP9对C2C12细胞成骨分化的影响。 2.通过Western blot检测C2C12细胞中早晚期成骨标志物的表达水平,以及PI3K/Akt信号转导活性的影响。 3.采用LY294002抑制PI3K/Akt,检测BMP9对C2C12细胞成骨标志物的表达影响。 4.分别采用Western blot、RT-PCR检测BMP9在C2C12细胞中对COX-2表达的影响。 5.采用NS-398抑制COX-2,检测BMP9对C2C12细胞成骨标志物的表达以及PI3K/Akt信号通路转导活性的影响。 实验结果: 1.在C2C12细胞中,BMP9使ALP活性增加,OPN、OCN蛋白表达水平升高,并能诱导钙盐沉积。 2.BMP9能呈浓度依赖性增加C2C12细胞中Akt1/2的磷酸化水平,PI3K/Akt抑制剂降低BMP9在C2C12细胞中诱导ALP活性增加。 3.BMP9在 C2C12细胞中促进 COX-2的 mRNA表达和增加COX-2的蛋白水平。 4.外源性COX-2促进BMP9诱导的C2C12细胞ALP活性增加, COX-2抑制剂减弱BMP9的诱导作用。 5.BMP9合并COX-2过表达增加p-Akt1/2的水平,对总Akt1/2表达水平无明显影响;COX-2抑制剂则能明显减弱BMP9对p-Akt1/2的促进作用,但对总Akt1/2表达水平也无明显影响。 实验结论: 激活PI3K/Akt信号转导与BMP9诱导C2C12细胞成骨分化的作用关系密切。BMP9激活该信号的机制可能与其上调COX-2表达有关。