巴西橡胶树Hevea brasiliensis是一种重要的热带经济作物,是天然橡胶的主要来源。炭疽病是橡胶树重要叶部病害之一。我国田间橡胶树炭疽病的主要病原菌是Colletotrichum siamense。HOG MAPK（High Osmolarity Glycerol Mitogen-Activated Protein Kinase）信号途径是真菌应对渗透压等各种胁迫反应所必需的,该途径与炭疽菌对咯菌腈等吡咯类杀菌剂敏感性密切相关,但其调控机制尚不清楚。碱性亮氨酸拉链b ZIP（basic region-leucine zipper）是真核生物转录因子家族之一,通过参与调控基因的表达来调节生物、非生物胁迫应答和发育等生理过程,转录因子ATF1是真核生物碱性亮氨酸拉链b ZIP（basic region-leucine zipper）转录因子家族成员之一。已有研究表明ATF1是HOG MAPK下游调控因子。本课题组前期通过转录组分析,证实了在Cs PBS2缺失突变体中,咯菌腈处理下Cs ATF1表达量显著下调。本研究以橡胶树炭疽菌中该转录因子Cs ATF1为研究对象,进一步分析Cs ATF1的功能及其互作蛋白,为了解炭疽菌应答胁迫反应,尤其是对咯菌腈等药剂敏感性调控的分子机制奠定基础。主要研究结果如下:1、克隆获得橡胶树炭疽菌转录因子Cs ATF1编码基因（登录号:MT084770）。分析显示,Cs ATF1基因DNA序列为1758bp,c DNA序列为1611bp,含有2个内含子,编码536个氨基酸,含有三个Aft1结构域和一个BRLZ（碱性亮氨酸拉链）结构域,根据聚类分析显示Cs ATF1与Colletotrichum fructicola的Cfb ZIP蛋白编码序列聚为一类,说明Cs ATF1为b ZIP转录因子家族中的ATF类转录因子。2、利用酵母双杂技术证实了转录因子Cs ATF1和Cs Hog1之间存在互作关系。并利用q RT-PCR技术分析了咯菌腈处理后转录因子Cs ATF1以及HOG MAPK途径关键基因Cs PBS2、Cs HOG1的表达量变化情况,结果显示,与对照相比,经杀菌剂咯菌腈（50mg/m L）处理后,Cs PBS2、Cs HOG1极显著上调表达,Cs ATF1极显著下调表达;研究结果说明Cs ATF1和Cs PBS2、Cs HOG1的表达受到咯菌腈药剂影响,但影响方式不同。3、通过同源重组技术获得Cs ATF1基因缺失突变体ΔCs ATF1-27。表型分析显示:与野生型相比,突变体ΔCs ATF1-27菌落形态无明显差异,菌落直径变小;分生孢子长度略有缩短（为野生型的92.74%）;高浓度盐胁迫对Cs ATF1基因的有显著影响,突变体对刚果红的敏感性显著高于野生型;Cs ATF1影响橡胶树炭疽菌咯菌腈敏感性;致病力测定显示,基因缺失突变体可形成病斑,但病斑面积约为野生型的38%,致病力下降。该研究结果表明转录因子Cs ATF1参与了炭疽菌分生孢子形态建成、细胞壁完整性、对咯菌腈等胁迫反应和致病功能。亚细胞定位结果显示,在菌丝和分生孢子中Cs ATF1基因都定位在细胞核内。4、以Cs ATF1为诱饵蛋白,利用酵母双杂技术筛选出15个阳性克隆,分析显示它们分别是mucoidy inhibitor-like protein、疏水蛋白、变性细胞壁蛋白phi A、锌乙醇脱氢酶、线粒体缺氧反应区含有蛋白HIG1、sun domain-containing protein、c-4 methylsterol氧化酶、锌乙醇脱氢酶、发育调控的MAPK相互作用蛋白、甲基转移酶、自噬相关蛋白2和5个假定蛋白。利用Co-IP技术进一步证实了线粒体缺氧反应区含有蛋白Cs HIG与Cs ATF1存在体内互作,但细胞壁蛋白Csphi A与Cs ATF1未发生体内互作。5、利用q RT-PCR技术分析了炭疽菌在咯菌腈、过氧化氢、氯化钠、山梨醇等胁迫处理后,Cs ATF1和互作蛋白Cs HIG编码基因Cs HIG的表达量的变化。结果显示,各胁迫处理能显著下调Cs ATF1基因表达。但互作蛋白编码基因Cs HIG表达量只受氯化钠、山梨醇影响,氯化钠的添加能显著上调Cs HIG基因表达,山梨醇的添加显著下调Cs HIG基因表达。研究结果可初步推测蛋白Cs HIG与转录因子Cs ATF1互作,参与氯化钠、山梨醇等渗透胁迫反应,不影响咯菌腈药剂敏感性和氧化胁迫反应功能。