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研究背景缺血性脑卒中(Ischemic stroke,IS)是指由于脑动脉管腔的狭窄或阻塞,导致灌流区的脑组织缺血、缺氧或坏死而产生的一系列病症的临床疾病。在中国,脑卒中是导致人口致死致残的首要病因,给个体和家庭带来了沉重的健康与经济负担。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的形成与发展是IS重要的病理生理基础。AS是以血管壁纤维化增生、脂质积聚、慢性炎症和免疫紊乱为病理性特征的疾病。氧化低密度脂蛋白(Oxidized-low density lipoprotein,ox-LDL)诱导的巨噬细胞炎症反应在AS的发生发展过程中起着关键作用,当巨噬细胞吞噬沉积在动脉内皮下方的ox-LDL后,能够刺激细胞产生大量的趋化因子与炎症因子,从而加重血管的炎症反应。DNA甲基化是DNA的一种化学修饰,是指在DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的作用下,将 S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)的甲基基团共价键结合在基因组CpG二核苷酸胞嘧啶的5’碳位上,从而形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)。DNA特定位点的甲基化修饰能引起DNA稳定性、DNA构象、染色质结构及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而调控基因的表达以及参与代谢通路的调节。课题组前期应用Illumina 850K甲基化芯片技术与MethylTarget目的区域甲基化测序技术初步发现缺血性脑卒中患者外周血CAMTA1基因启动子区CpG岛的甲基化水平升高,与健康对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。钙调蛋白结合转录激活因子 1(Calmodulin binding transcription activator 1,CAMTA1)属于钙调蛋白转录激活因子家族,包含有IQ基序,可能通过与钙调蛋白的直接结合来响应钙信号通路。全基因组关联和大规模候选基因研究发现CAMTA1基因的变异与早发冠状动脉疾病相关。有研究报道CAMTA1可能参与钙调神经磷酸酶/活化 T 细胞核因子(Calcineurin/nuclear factor of activated T cell,CaN/NFAT)信号通路的正调节,进而参与细胞的免疫调节。综上所述,本课题提出如下假说:CAMTA1基因启动子区的甲基化水平升高,参与调节CAMTA1基因的表达,并通过影响细胞的炎症反应,参与IS的病理进程。本课题将研究DNA甲基化对CAMTA1基因表达的影响,并进一步研究CAMTA1蛋白参与IS的功能机制,为探究IS发病的遗传学机制以及探寻有效的IS防治方法提供实验依据。材料与方法第一部分:CAMTA1基因启动子区甲基化与缺血性脑卒中的相关性研究1.研究对象:病例组选取2017年10月至2019年3月期间在河南中医药大学第一附属医院住院、郑州市第一人民医院住院的IS患者共110例;对照组选取同期性别、年龄与IS病例组相匹配的健康体检个体110例。本研究方案已通过郑州大学伦理委员会的批准。2.使用血液基因组DNA提取试剂盒对外周血DNA进行提取,采用MethylTarget目的区域甲基化测序技术对CAMTA1基因启动子区的CpG岛甲基化水平进行检测。3.使用血液总RNA提取试剂盒对外周血总RNA进行提取,采用qPCR技术对CAMTA1基因mRNA表达水平进行检测。4.使用Ficoll密度梯度分离的方法分离提取外周血单个核细胞,采用qPCR技术与Western blot技术对CAMTA1基因的表达水平进行检测。第二部分:CAMTA1对ox-LDL诱导THP-1源性巨噬细胞炎症因子表达的影响1.使用浓度为80 μg/mL的ox-LDL分别处理THP-1巨噬细胞0,6,12,24,48h,ELISA检测细胞上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β的含量。2.使用siRNA-CAMTA1转染THP-1巨噬细胞,ELISA检测细胞上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β 的含量。3.使用CAMTA1过表达质粒转染THP-1巨噬细胞,ELISA检测细胞上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β 的含量。研究结果1.IS病例组CAMTA1基因启动子区CpG岛的平均甲基化水平显著高于对照组(P<0.05),其中CpG16与CpG21这两个位点的甲基化水平在病例组与对照组之间存在显著性差异(P<0.05);经性别分层分析,CAMTA1基因启动子区的甲基化水平在病例与对照组之间无显著性差异(P>0.05)。2.IS病例组外周血CAMTA1基因mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.01)。3.CAMTA1基因启动子区甲基化与CAMTA1基因mRNA表达水平之间呈负相关,具有统计学意义(P<0.0001)。4.IS病例组单个核细胞中CAMTA1基因mRNA以及蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.01)。5.ox-LDL处理THP-1巨噬细胞24 h,IL-6、TNF-α、IL-1β的分泌最为显著(P<0.01)。6.THP-1巨噬细胞特异性敲低CAMTA1,细胞上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β的浓度均显著下降(P<0.01)。7.THP-1巨噬细胞过表达CAMTA1,细胞上清液中IL-6、TNF-α的浓度显著上升(P<0.01)。结论1.缺血性脑卒中患者CAMTA1基因启动子区高甲基化抑制CAMTA1 mRNA的表达,进而导致CAMTA1蛋白表达下降。2.在ox-LDL诱导的AS炎症模型中,敲低CAMTA1能够抑制ox-LDL诱导的THP-1源性巨噬细胞炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β的分泌。3.在ox-LDL诱导的AS炎症模型中,过表达CAMTA1能够促进ox-LDL诱导的THP-1源性巨噬细胞炎症因子IL-6和TNF-α的分泌。