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人巨细胞病毒（HCMV）感染新生儿、艾滋病人和器官移植病人等免疫低下人群后,易引起严重的HCMV相关疾病。接种疫苗是控制病毒感染的最好手段,然而目前研究的HCMV疫苗免疫效果欠佳,尚未应用于临床。HCMV抗原能否提供有效的抗感染保护以及采用怎样的免疫策略,是很值得探讨的问题。本文根据前期的大量准备和实验基础,以鼠巨细胞病毒（MCMV）感染小鼠为模型,选择与HCMV同源的MCMV即刻早期蛋白IE-1的DNA疫苗和蛋白疫苗为研究对象,探讨以下问题:1)原核表达的rIE-1蛋白疫苗免疫小鼠后诱导的免疫应答和抗致死剂量MCMV感染的保护效果,以及通过不同途径（腹腔注射或滴鼻途径）免疫小鼠后的保护效果;2)IE-1 DNA疫苗和rIE-1蛋白疫苗联合免疫小鼠后诱导的免疫应答和保护效果;3)包括IE-1 DNA在内的五种表达不同抗原的DNA疫苗在小鼠中提供免疫保护的能力。论文由以下五个部分组成:（一）引言简单综述HCMV及其致病性与免疫性、疫苗的研究进展、主要基因和编码蛋白特征功能、以及针对IE-1的免疫应答对宿主的潜在保护力等;（二）即刻早期蛋白IE-1的原核表达将MCMV IE-1基因插入原核表达质粒p ET28a,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达纯化出重组蛋白rIE-1,对rIE-1的诱导条件进行优化以及纯化后对rIE-1作简单鉴定;（三）IE-1亚单位疫苗抗病毒感染的研究以不同剂量的rIE-1蛋白疫苗经腹腔注射或滴鼻途径免疫小鼠两次,免疫后以致死剂量（3×LD50）的高毒力SG-MCMV攻击小鼠。该疫苗免疫均可在小鼠体内诱导出MCMV IE-1特异性的体液免疫和细胞免疫,并且应答水平与疫苗的剂量呈剂量相关性。小鼠在攻毒后体重丢失减少且脾脏中病毒滴度降低。经腹腔免疫的小鼠存活率最高为87.5%,而经滴鼻免疫的小鼠存活率最高仅为25%,说明rIE-1蛋白经腹腔免疫途径诱导的保护效果优于滴鼻免疫。同时,为了增强rIE-1蛋白疫苗的免疫效果,我们分别以rIE-1蛋白+MF59佐剂经腹腔免疫小鼠和rIE-1蛋白+CTB*粘膜佐剂经滴鼻免疫小鼠。结果表明加了MF59佐剂的rIE-1蛋白疫苗诱导小鼠产生的IE-1特异性IgG抗体滴度、分泌IFN-γ的CD8+T细胞数目与相同剂量rIE-1单独免疫的小鼠相比均显著上升;加了CTB*佐剂后免疫的小鼠比单独免疫的小鼠产生的IE-1特异性IgG滴度、分泌IFN-γ的CD8+T细胞数目有显著性差异。辅以两种佐剂后rIE-1蛋白疫苗相比单独蛋白疫苗能提供小鼠更好的抗MCMV保护力,减少体重丢失,显著降低脾脏中病毒滴度,但是小鼠脾脏中仍能检测到病毒。更重要的是添加了MF59佐剂的rIE-1蛋白疫苗经腹腔注射可以提供小鼠完全保护力,而辅以CTB*佐剂的rIE-1蛋白提供小鼠的保护力不超过50%。本实验证明了rIE-1蛋白具有较好的免疫原性,添加了MF59或CTB*佐剂的rIE-1蛋白疫苗免疫小鼠,IE-1特异性的体液应答和T细胞应答水平均显著上升;同时腹腔注射小鼠提供的免疫保护优于滴鼻免疫,单独或辅以佐剂后能提供小鼠抗MCMV感染的保护力,特别是MF59/rIE-1可提供小鼠抗MCMV感染的完全保护。（四）IE-1核酸疫苗和亚单位蛋白疫苗联合免疫抗病毒感染的研究小鼠用IE-1 DNA疫苗（D1组）或rIE-1蛋白疫苗（P1组）免疫一次,或以IE-1 DNA初免接着以rIE-1蛋白加强一次（D1P1组）,或蛋白疫苗免疫二次（P2组）。DNA疫苗采用肌肉注射辅以电击方式接种,而rIE-1蛋白分别采用腹腔注射或滴鼻免疫方式接种小鼠。免疫后用致死量（3LD50）病毒攻击小鼠。结果表明,pIE-1 DNA单独免疫一次,诱导小鼠产生了较高的CD8+T细胞数目,并提供小鼠37.5%的保护。而当rIE-1蛋白疫苗采用腹腔途径免疫时,P1、P2和D1P1组小鼠保护率和CD8+T细胞数目依次增加,脾脏中病毒滴度依次下降;D1P1组小鼠CD8+T细胞数目分别和前两组小鼠之间有显著性差异;D1P1组（100%）或P2组（75%）小鼠的存活率相比对照组（0%）小鼠存活率显著上升。当rIE-1蛋白采用滴鼻方式免疫后,各组小鼠存活率与对照组小鼠相比无显著性差异,D1P1组小鼠存活率最高,达到50%;P1、P2和D1P1三组小鼠CD8+T细胞数目依次增加,脾脏中病毒滴度依次下降;并且D1P1组小鼠脾脏病毒滴度和P1组小鼠之间有显著性差异。本实验证明了IE-1 DNA疫苗和蛋白联合免疫的“异源初免-加强”策略相比蛋白单独免疫能增强小鼠的T细胞应答,降低脾脏中的病毒滴度,相比IE-1DNA疫苗和蛋白疫苗单独免疫能提供更好的保护力。（五）几种核酸疫苗的免疫保护效果比较克隆五个MCMV基因（m04、M84、M105、IE-1和M55）,分别构建成五种DNA疫苗,其中前四种分别编码MCMV gp34、p65、DNA解旋酶和IE-1 pp89（IE-1）蛋白,这些抗原主要诱导CD8+T细胞应答,而M55编码gB蛋白,是中和抗体的诱导者。小鼠分别经DNA疫苗免疫1～4次,随后用免疫后用致死量（3LD50）病毒攻击小鼠。结果发现,M84DNA免疫一次以上或m04、IE-1免疫两次以上,能使小鼠在致死剂量MCMV感染后存活率达到100%,而免疫M55或M105 DNA疫苗四次小鼠存活率为62.5%;这些DNA疫苗能有效降低唾液腺和脾脏器官中的病毒滴度,但不能完全清除器官中的残留病毒。本研究表明DNA疫苗能有效提供小鼠抗高毒力MCMV的感染,通过诱导的CD8+T免疫提供的保护效果优于gB特异性抗体。本文的研究成果可为HCMV疫苗的研发提供一些有益的参考。