血管生成是机体在血管已经存在的情况下发生的一种血管再生现象,相对于血管新生,血管生成一般发生在成熟的生物体内。肝再生过程是一种伴随血管生成发生的过程,研究肝再生过程的血管生成相关信号网络,一直得到持续的关注。血管的形成这一复杂的生理现象,受一系列促血管生成和抗血管生成因子的调控。肝切除手术诱导的血管生成同样是由许多血管生成相关的因子所启动,这些因子包括研究较为广泛的HIF1A,IL6等。这些血管生成相关因子启动的信号传递到细胞内的过程,必不可少的会产生与膜上受体的应答。微区作为质膜上信号受体聚集的平台,对于信号的传递,特别是快速而高效的信号传递作用十分巨大,研究微区上与血管生成相关的质膜蛋白对于揭示血管生成因子在细胞间的信号传递具有十分重要的意义。特别是微区上主要的受体种类如受体酪氨酸激酶家族,蛋白磷酸酶家族,脂锚定蛋白家族和G蛋白及G蛋白偶联受体家族等,均与内皮细胞上血管生成受体家族极大的吻合。而一些微区上已经鉴定到的受体蛋白,如u PAR,MMP-9,flotillin-1和caveolin-1等都有报道和血管生成关系密切。本研究主要从三个方面对大鼠肝切除诱导的肝再生过程中血管生成相关的膜蛋白进行研究。第一部分通过对微区上富集的血管生成相关质膜蛋白进行定量研究,拟揭示微区对于血管生成相关受体的招募作用;第二部分通过对再生肝脏质膜微区蛋白磷酸化修饰状态进行研究,拟揭示微区对血管生成相关蛋白的快速信号传递;第三部分研究了血窦内皮细胞质膜蛋白硝基化修饰水平,拟发现硝基化修饰对血管再生终止调控的影响。首先,我们沿用了课题组开发的各种质膜蛋白质的提取富集手段,对与血管生成事件相关的微区质膜蛋白进行定量研究。通过i TRAQ标记定量,我们总共鉴定到734个微区上的蛋白质,其中258个存在表达量0.8/1.2倍的差异。差异表达的蛋白,主要参与信号转导、膜泡运输、细胞粘附等途径。为了检测微区上蛋白表达水平是否伴随整个细胞转录水平变化,我们通过生物信息学分析结合文献检索,对编码微区上与血管生成相关蛋白的基因,进行了定量RTPCR检测。这21个调控血管生成的基因中,在转录水平上调的基因有11个,其中三个呈一过性上调;转录水平下调基因10个。其中m RNA水平和微区蛋白表达水平差异极显著的蛋白酶激活受体4（protease activated recept or 4,PAR4）具有较为典型的微区作用模式,我们挑选其作为进一步研究对象,通过定量PAR4蛋白在全细胞裂解液、细胞质膜和质膜微区上的表达情况,证明微区作为信号受体聚集的平台,在肝切除48 h和72 h后,对PAR4蛋白的招募作用。微区上蛋白质通过聚集到一起,极大的缩短了信号传递过程中的空间位阻,这对于信号在胞内的传递意义重大。而多位点磷酸化修饰的蛋白质在信号网络中可能充当超级灵敏的开关,从而作用于细胞间的信号串道（cross-talk）。研究脂筏上磷酸化位点修饰情况,可以更好的为研究血管生成信号在细胞间的传递提供线索。本研究利用SDS-PAGE结合磷酸化修饰荧光染色技术获得潜在的磷酸化修饰条带,之后利用Ti O2选择性富集磷酸化修饰肽段,有效富集和鉴定大鼠肝再生模型中的磷酸化修饰微区蛋白质。肝切除0小时,我们共鉴定到1489条肽段,对应142个蛋白。其中327条磷酸化肽段,对应106个磷酸化蛋白。肝切除72小时,共鉴定到1227条肽段,对应140个蛋白。其中270条磷酸化肽段,对应105个磷酸化蛋白。总共166个磷酸化修饰蛋白,其中同时在0 h和72 h鉴定到的蛋白45个,17个磷酸化蛋白虽然在肝切除0小时与72小时内被共同鉴定到,但是他们的磷酸化位点却有差异表达。通过对鉴定到的微区磷酸化修饰蛋白质进行聚类发现,这些蛋白质主要参与代谢（69）与响应胞外刺激（43）进程,这与微区作为信号受体聚集的平台的功能是一致的,同时也说明微区可能介导细胞间通讯。分析肝再生血窦内皮细胞质膜定量数据发现,肝切除72小时后,血窦内皮细胞质膜上调控凋亡的信号如PKC开始表达上调,而肝再生过程各细胞增殖时间曲线显示,肝切除96小时血窦内皮细胞增殖才进入最高峰。因此我们猜想肝实质细胞增殖过程中产生的氧化损伤通过时间的累积,最终引起蛋白质发生硝基化修饰氧化应激,从而参与调控抑制肝血窦内皮细胞的增殖,进而调控血管生成的终止。本研究开展了对血窦内皮细胞质膜硝基化修饰蛋白质组学的研究,首先酪氨酸硝基化修饰抗体染色结果显示血窦内皮细胞质膜蛋白质的硝基化修饰水平上升,提示硝基化修饰有可能参与肝再生终止信号。通过2-D IEF-SDS PAGE结合串联质谱技术,我们鉴定了酪氨酸硝基化修饰显影阳性区域的凝胶质点,一共获得了639个蛋白（包括硝基化修饰与非硝基化修饰蛋白）,其中包括17条硝基化修饰肽段对应16个硝基化修饰蛋白。鉴定到的硝基化修饰蛋白包括肌动蛋白、磷脂酰肌醇4磷酸激酶3和己糖激酶-1等参与调控心血管发育的蛋白,以及溶质载体家族25成员34（Slc25a34）,己糖激酶1,己糖己糖磷酸酶6（Ins P6）,染色体结构维持蛋白（SMC）等调控细胞周期的蛋白。这些蛋白发生硝基化修饰可能影响其对于心血管发育和细胞周期的调控,从而对血管再生进程产生负调控。结果提示蛋白质硝基化可能作为一种新的调控血管生成终止的信号影响肝再生可控性。