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帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见的神经退行性疾病,其典型的病理学特征是黑质致密部多巴胺能神经元的丢失以及残存神经元内路易小体的形成。路易小体的主要成分是错误折叠和聚集的α-突触核蛋白。除了其细胞内分布,α-突触核蛋白在细胞外主要以游离形式或外泌体形式存在。虽然外泌体形式α-突触核蛋白较少,但是外泌体α-突触核蛋白毒性更强,更容易被邻近细胞所摄取。目前认为,α-突触核蛋白的细胞间传播是PD进程呈进行性发展的重要原因。铁是人体所必需的重要微量元素之一。正常生理情况下,多巴胺能神经元内铁维持稳态,但在PD状态下,黑质区和残存的多巴胺能神经元内出现铁沉积。细胞内铁沉积可通过芬顿反应引起氧化应激,还可诱导铁死亡,是神经退变发生的重要机制之一。作为PD的两大重要的神经病理学表现,多巴胺能神经元内铁沉积和α-突触核蛋白聚集存在相互促进关系。然而细胞内铁沉积是否及如何影响α-突触核蛋白的细胞外释放尚未见研究报道。本实验在体外培养的诱导高表达野生型（Wild type,WT）和A53T突变型人源α-突触核蛋白的PC12细胞（WT hα-syn PC12细胞和A53T hα-syn PC12细胞）模型中,应用免疫印迹法检测细胞内α-突触核蛋白的表达变化及聚集。在WT hα-syn PC12细胞中,应用免疫印迹法、纳米颗粒跟踪分析法（Nanoparticle tracking analysis,NTA）检测外泌体数目变化;应用斑点杂交法检测总外泌体中聚集形式的α-突触核蛋白含量;应用酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）观察细胞上清、外泌体中α-突触核蛋白含量的变化;应用铁试剂盒检测细胞裂解液、细胞上清、外泌体中铁浓度的变化。应用免疫印迹法检测细胞内铁死亡标记物谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione peroxidase 4,GPX4）,α-突触核蛋白,小分子GTP酶Rab7、Rab11、Rab35蛋白的表达变化。本实验拟阐明细胞内铁沉积对外泌体α-突触核蛋白释放的影响,并探讨其可能机制。研究结果如下:1.用2μg/m L多西环素（Doxycycline,DOX）诱导PC12细胞高表达WT人源α-突触核蛋白,处理12 h、24 h时α-突触核蛋白表达量与对照组相比均明显上调（P<0.001,P<0.001）;与处理12 h组相比,处理24 h组α-突触核蛋白表达量上调更明显（P<0.05）。在后续实验中选择用2μg/m L DOX处理24 h的PC12细胞（WT hα-syn PC12细胞）。用2μg/m L DOX处理24 h诱导PC12细胞高表达A53T突变型人源α-突触核蛋白（A53T hα-syn PC12细胞）。2.用100μmol/L枸橼酸铁铵（Ferric ammonium citrate,FAC）处理WT hα-syn PC12细胞24 h,FAC组Triton X-100可溶性、Triton X-100不可溶性α-突触核蛋白的表达量与对照组相比均明显上调（P<0.001,P<0.05）。在A53T hα-syn PC12细胞中也观察到了FAC处理组Triton X-100可溶性、Triton X-100不可溶性α-突触核蛋白的表达量与对照组相比均明显上调（P<0.001,P<0.01）。结果表明,细胞内高铁可促进WT和A53T型α-突触核蛋白的表达和聚集。3.在WT hα-syn PC12细胞中,分别用10μmol/L铁死亡诱导剂Erastin、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1预处理30 min后再分别加入100μmol/L FAC共处理12 h、24 h。处理12 h时,各组GPX4、α-突触核蛋白表达水平均没有变化（P>0.05）。处理24 h时,FAC和Erastin共处理组与对照组相比GPX4表达下调（P<0.05）,其它各组均没有变化（P>0.05）,提示在铁死亡诱导剂存在时,细胞内铁沉积可诱导明显的铁死亡;FAC组、FAC和Erastin共处理组、FAC和Ferrostatin-1共处理组与对照组相比α-突触核蛋白均表达上调（P<0.05,P<0.001,P<0.05）,且FAC和Erastin共处理组α-突触核蛋白表达上调比单独FAC组更明显（P<0.001）。结果表明,在WT hα-syn PC12细胞中,铁死亡可能促进α-突触核蛋白的表达。4.用超速离心法提取外泌体后,用免疫印迹法检测到外泌体标记蛋白Alix表达。用透射电子显微镜（Transmission electron microscopy,TEM）观察到外泌体呈杯状。用NTA检测到外泌体粒径峰值为108.1 nm-118.8 nm,平均粒径为127.8 nm-148.2 nm。5.用100μmol/L FAC处理WT hα-syn PC12细胞24 h后提取外泌体,免疫印迹检测结果显示,与对照组相比,FAC组外泌体标记蛋白Alix、Flotillin-1表达下调（P<0.01,P<0.01）;NTA检测结果显示,与对照组相比,FAC组外泌体数目减少（P<0.001）,粒径峰值、平均粒径分布均无差异。结果表明,细胞内高铁可减少外泌体释放的数目。6.用100μmol/L FAC处理WT hα-syn PC12细胞24 h后提取外泌体,斑点杂交检测结果显示,与对照组相比,FAC组总外泌体中聚集形式的α-突触核蛋白含量降低（P<0.01）。ELISA试剂盒检测结果显示,与对照组相比,FAC组细胞上清中α-突触核蛋白含量没有变化（P>0.05）;单个外泌体中α-突触核蛋白含量升高（P<0.01）。结果表明,细胞内高铁可降低总外泌体中聚集形式的α-突触核蛋白含量,但单个外泌体中α-突触核蛋白的总含量明显升高。7.用100μmol/L FAC处理WT hα-syn PC12细胞24 h后提取外泌体,铁试剂盒检测结果显示,与对照组相比,FAC组细胞裂解液、细胞上清和外泌体中铁含量均升高（P<0.05,P<0.001,P<0.01）。8.无论是在DOX诱导高表达WTα-突触核蛋白的WT hα-syn PC12细胞,还是在未加DOX诱导的PC12细胞中,用100μmol/L FAC处理12 h时,与对照组相比,FAC组Rab7、Rab11蛋白表达水平均没有变化（P>0.05）,但Rab35蛋白表达上调（P<0.05,P<0.01）;处理24 h时,FAC组Rab7、Rab11、Rab35蛋白表达水平均没有变化（P>0.05）。在WT hα-syn PC12细胞中,分别用10μmol/L Erastin、Ferrostatin-1预处理30 min后再分别加入100μmol/L FAC共处理12 h时,各组Rab7、Rab11蛋白表达水平均没有变化（P>0.05）。FAC组、FAC和Erastin共处理组与对照组相比Rab35蛋白表达均上调（P<0.01,P<0.05）,Ferrostatin-1可阻断FAC诱导的Rab35上调（P<0.05）。处理24 h时,FAC和Ferrostatin-1共处理组与对照组、FAC组相比Rab35蛋白表达下调（P<0.001,P<0.001）,其它各组Rab7、Rab11、Rab35蛋白表达水平均没有变化（P>0.05）。结果表明,Rab35蛋白的表达调控可能与铁死亡相关,但Rab蛋白的表达变化可能不参与铁调控外泌体的释放。以上结果表明,细胞内铁沉积可促进PC12细胞中细胞内WT和A53T型α-突触核蛋白的表达上调与聚集,并且铁死亡可能促进铁诱导的α-突触核蛋白的表达上调;铁沉积可减少外泌体释放的数量,且减少总外泌体中聚集形式的α-突触核蛋白含量,但同时单个外泌体中α-突触核蛋白及铁含量增加。Rab蛋白的表达变化可能不参与铁调控外泌体的释放。本实验探讨了细胞内铁沉积对外泌体α-突触核蛋白释放的影响并探讨可能机制,为进一步研究α-突触核蛋白的细胞间传播提供了新的实验依据。