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鸭坦布苏病毒病是鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)引起的以产蛋下降、生长迟缓为主要特征的鸭新发传染病,肉鸭及蛋鸭均能感染该病。该病群内发病率能达到100%,死淘率为5%~15%。免疫接种是预防与控制该病的关键性措施之一,研制安全、有效,且能够有效区分疫苗免疫和野毒感染的新型疫苗对该病的防控至关重要。鸭坦布苏病毒囊膜蛋白E蛋白构成DTMUV的主要抗原表位,与病毒的吸附有关,诱导机体产生特异性中和抗体,引起保护性免疫反应。本研究首先构建了表达DTMUV E蛋白的重组腺病毒疫苗,并对其免疫效果的进行初步分析。根据鸭坦布苏病毒AH-F10株(GenBank登录号:KM102539)的E基因序列设计了一对特异性引物。提取鸭坦布苏病毒的RNA,并扩增目的基因。将目的基因连接至穿梭载体pacAd-CMV K-NpA中。将PCR、酶切及测序鉴定正确的重组穿梭质粒用Pac I酶线性化,之后与同样经Pac I酶线性化的骨架载体pacAd5 9.2-100共转染AAV-293细胞,包装出重组腺病毒rAd-E。将rAd-E感染AAV-293细胞,连续传代,均可产生明显细胞病变,表明rAd-E具有良好的遗传稳定性。检测第8代重组腺病毒滴度,TCID50为10-6.17/0.1mL。间接免疫荧光和Western blotting试验结果表明,重组腺病毒可以在体外表达E蛋白,且该表达的重组E蛋白具有良好的反应原性。应用构建的表达E蛋白的重组腺病毒载体进行了免疫保护试验。将7日龄健康雏鸭随机分成4组,分别免疫重组腺病毒rAd-E,免疫剂量为108TCID50、鸭坦布苏病毒病AH-F10株油乳灭活苗(阳性对照),免疫剂量为0.5m L、wt Ad免疫剂量为108TCID50、PBS注射0.5mL,2周后用同等剂量加强免疫一次。免疫前后分别对各组试验鸭颈静脉采血,分离血清,进行DTMUV特异性抗体、中和抗体检测,同时分离外周血进行淋巴细胞增殖试验。二次免疫后2周进行攻毒保护试验。应用DTMUV AH-TL15野毒株攻毒所有雏鸭,攻毒剂量为0.5mL(ELD50为10-2.38/0.1mL)。记录发病及死亡情况,并剖检存活鸭只,制作病理切片。结果显示,重组腺病毒rAd-E免疫雏鸭后1周可诱导鸭坦布苏病毒特异性抗体的产生,抗体水平显著高于PBS组和wtAd组,但低于阳性对照组;中和抗体滴度最高达到1:16,低于阳性对照组,PBS组和wtAd组均未检测到中和抗体。淋巴细胞增殖试验结果显示rAd-E组的刺激指数最高,阳性对照组次之,且两组之间差异显著(P<0.05);IL-4和IFN-γ蛋白含量也显著高于阳性对照组,表明重组腺病毒免疫组有效地诱发了细胞免疫反应。攻毒保护试验和HE染色结果显示阳性对照组雏鸭的保护率达到100%,重组腺病毒的保护率达到80%,PBS组和wtAd组雏鸭全部发病。阳性对照组和重组腺病毒组的各组织没明显病变,PBS组和wtAd组的肝脏空泡变性、脾脏和胰脏淋巴细胞浸润、脑组织有血管周围袖套,有噬神经细胞现象。说明重组腺病毒载体疫苗对鸭坦布苏病毒有较好的保护作用。综上所述,构建的表达E蛋白的重组腺病毒rAd-E,能诱导健康鸭产生特异性体液免疫应答和细胞免疫应答,且对野毒攻毒有较好保护雏鸭抵御DTMUV感染。研究结果为DTMUV感染防控及其基因工程疫苗的研究提供重要参考。