卵巢癌紫杉醇耐药细胞SKOV3-TR30中miR-210靶基因筛选与验证

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目的:应用Hybird-PCR方法在人卵巢癌紫杉醇耐药细胞SKOV3-TR30中筛选miR-210的潜在靶基因并进行验证。  方法:通过培养SKOV3-TR30细胞,并抽提总RNA,利用Hybird-PCR的方法及测序,用BioEdit和DNAclub分析所有测序结果,并运用BLAST分析确定筛选出的靶mRNA的确切信息。然后通过候选靶基因的3UTR荧光素酶报告基因质粒以及miRNA共转染HEK293细胞进行双荧光素酶报告基因检测。最后在卵巢浆液性癌化疗耐药和卵巢浆液性癌化疗敏感组织中验证筛选得到的候选靶基因有无表达以及是否可以在卵巢癌耐药中发挥作用。  结果:1.Hybrid-PCR方法筛选出SKOV3-TR30中miR-210的潜在靶基因有:FGD4,,ATXN1, EFNA3, ABCC1。  2.成功构建筛选出的miR-210靶基因FGD4,,ATXN1,EFNA3,ABCC1的3-UTR荧光素酶报告基因质粒。  3.通过荧光素酶报告基因检测显示miR-210对候选靶基因3-UTR区均具有直接结合作用。  4.应用Western Blot在12例卵巢浆液性癌耐药组织和12例卵巢浆液性癌敏感组织中验证发现筛选出的miR-210靶基因FGD4,,ATXN1,EFNA3,ABCC1的表达有差异,可能在卵巢癌耐药中发挥作用。  结论:在人卵巢癌浆液性耐药细胞SKOV3-TR30中,通过运用Hybrid-PCR方法共筛选得到4个miR-210候选靶基因:FGD4,,ATXN1,EFNA3,ABCC1;荧光素酶报告基因检测显示miR-210对候选靶基因3-UTR区均具有直接结合作用;通过Western Blot方法在候选靶基因中FGD4在卵巢癌化疗耐药组中表达低于化疗敏感组,ATXN1在卵巢癌化疗耐药组中表达低于化疗敏感组,表明FGD4,ATXN1与卵巢癌耐药有关。miR-210可能通过调控这些靶基因在卵巢癌耐药中发挥了重要作用。
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