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凝血途径分为内源性凝血途径和外源性凝血途径,现代血液学理论认为外源性凝血途径在生理性止血和病理性凝血中占主要地位。外源性凝血途径起始于组织因子(tissue factor,TF),故又称组织因子途径。组织因子途径抑制物(TissueFactor Pathway Inhibitor,TFPI)是外源性凝血途径的特异性抑制物。TFPI 成熟蛋白质分子含 276 个氨基酸残基,由富含酸性氨基酸的 N 端、K1、K2 和 K3 三个串联的 Kunitz 型结构域以及富含碱性氨基酸的 C 端五部分组成。TFPI 的抗凝活性主要由 K1 和 K2 发挥作用,K2 可以直接与 FXa 结合并抑制其活性,K1 通过 TFPI/FXa 复合物与 FVIIa/TF 结合形成四元复合物并抑制其活性。除抗凝活性外,TFPI 还具有抗炎、抑制血管生成和肿瘤生长、抑制内皮细胞增殖、诱导细胞凋亡,以及抑制血管新生内膜过度增生等多种生物功能,具有重要的理论研究价值和开发应用前景。 我们以人胎盘组织总 RNA 为模板,用 RT-PCR 获得 TFPI cDNA 基因,通过优化 N 端密码子,实现了在大肠杆菌中表达重组 TFPI,后者以包涵体形式存在于菌体内,表达量占全菌总蛋白的 10%,经复性、纯化后重组 TFPI 纯度大于 95%,比活性 18,440U/mg,产率 30mg/L。 TFPI 的 K3 和 C 末端是 TFPI 与 CD14、肝素和低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)等分子相互结合的部位,也是 TFPI 进入细胞代谢、发挥抗炎作用和最佳抗凝活性及其它多种生物学活性所必需的结构。为研究 TFPI 结构和功能及其相互关系,我们研制了缺失突变体 TFPI1-161。TFPI1-161仅包含 N 末端、K1 和 K2,缺失了 K3 和 C 末端,具有半衰期长、作用缓和、出血少、抗凝功能单一等特点,在高凝状态和血栓病的预防和治疗方面具有广泛应用前景。 我们以野生型 TFPI 基因为模板,用 PCR 方法获得 TFPI1-161cDNA 基因,在筛选多拷贝转化子的基础上,首次在巴斯德毕赤酵母中进行了该基因的高效表达,表达量高于酿酒酵母 20 倍以上,表达产物分泌在培液上清中,占上清中总蛋白的 70%以上。由于糖基化程度不同,TFPI1-161 表现为 TFPI1-161(24KD)和TFPI1-161(27KD)两种分子形式,等电点分别为 4.8 和 4.9,经纯化后纯度均大于95%,比活性分别为12,880U/mg和12,400U/mg,产率分别为350mg/L和450mg/L。 弥散性血管内凝血 (DIC) 是一种常见的临床综合征,起病急、病情危重、预后差,引起本病的基础疾病涉及临床各个学科。目前的治疗药物主要为肝素,剂量难以把握,存在诱发血小板减少、出血和骨质疏松等众多不良反应。由于绝 I<WP=5>中文摘要大多数 DIC 都与 TF 途径激活有关,故阻断 TF 途径已成为防治 DIC 的新思路。动物实验和临床研究证明,重组 TFPI 对 DIC 具有良好的疗效。但是,重组 TFPI的半衰期很短,进入血液后迅速被代谢,因此用药量较大,持续使用时间长,临床使用不便,患者经济负担沉重。因此,延长重组 TFPI 的半衰期,可提高其临床使用价值,是目前急待解决的问题。 TFPI 主要通过 K3 和 C 末端与肝细胞表面受体 LRP 结合后进入细胞代谢。TFPI 的 K3 和 C 末端富含碱性氨基酸,LRP 的配体结合结构域富含酸性氨基酸,静电引力在两者结合时发挥主要作用。我们应用蛋白质结构生物学原理,在计算机工作站上对 K3 和 C 末端进行同源模建,并与 LRP 进行分子对接,发现了 TFPI分子中与 LRP 相互作用的 4 个关键氨基酸:K241、K254、K260 和 K261。将距离 LRP 分子最近的 K254 突变为中性丙氨酸,突变体命名为 TFPI-Mut1;将 4 个赖氨酸全部突变为丙氨酸,突变体命名为 TFPI-Mut4。计算机模拟显示,引入突变后,与野生型 TFPI 相比,TFPI-Mut1 和 TFPI-Mut4 在对接复合物中的空间取向发生了一定程度的旋转,对接复合物的相对吉布斯自由能分别下降了 17.3%和21.5%。 我们以野生型 TFPI 基因为模板,分别用 Megaprimer PCR 和 Gene SOEing方法获得 TFPI-Mut1 和 TFPI-Mut4 的 cDNA 基因,分别实现了二者在大肠杆菌中的表达,表达产物以包涵体形式存在于菌体内,表达量均约占全菌总蛋白的10%,经复性、纯化后获得的重组 TFPI-Mut1 和 TFPI-Mut4 纯度均大于 95%,比活性与野生型 TFPI 相近,分别为 18390U/mg 和 18350U/mg,产率分别为 32mg/L和 34mg/L。 药代动力学研究显示,与野生型 TFPI 相比,TFPI-Mut1 和 TFPI-Mut4 在大鼠体内的分布相半衰期 t1/2 分别延长 1.33 倍和 1.96 倍,消除相半衰期 t1/2 分别 α β延长 1.62 倍和 4.22 倍,实验结果与计算机模拟相符,达到了保持活性,延长半衰期的目的。 我们应用经典的两次注射细菌内毒素的方法制造兔 DIC 模型,供药效学研究。结果显示:小剂量 TFPI 和 TFPI-Mut4(0.5μg/kg/min,连续注射 24h)对实验性 DIC 均有显著疗效,可显著增加血小板计数和血浆纤维蛋白原(Fbg)水平,缩短激活的部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT),降低血浆D-Dimmer 和 FDP 水平,TFPI-Mut4 的治疗效果优于 TFPI。药效学和临床前研究正在进行中。