研究背景、存在的科学问题及研究意义昆虫生长发育主要受胰岛素(insulin)、蜕皮激索(20E)和保幼激素(JH)调控。Insulin对细胞的增殖和生长起着重要的调控作用,而20E和JH主要调控蜕皮与变态,三种激素间存在相互作用,共同调控生长发育及蜕皮变态。当JH存在的时候,高浓度的20E能够启始幼虫期蜕皮的发生,当JH滴度下降或消失的时候,高浓度的20E则启动昆虫变态,而insulin则通过促进幼虫生长,使前胸腺合成高浓度的蜕皮激素参与生长和变态调控。变态期幼虫组织凋亡,成虫组织形成,其中,幼虫中肠的解体与成虫中肠的重建涉及细胞程序性死亡和细胞增殖,是目前研究的热点。蛋白激酶能通过促进底物的磷酸化来参与多种重要的生理过程,多种蛋白激酶在促进细胞程序性死亡的过程中发挥着重要的功能,CKS1作为细胞周期的重要调控蛋白,能够与CDK及Cyclin相互作用,共同调控细胞的增殖。但促细胞死亡激酶与CKS1在昆虫的生长发育及变态过程中的功能尚不清楚,Insulin、20E和JH如何调控这些基因表达也不清楚。研究CKS1和促细胞死亡蛋白激酶在昆虫生长发育及变态过程中的功能及激素调控,可以进一步阐释激素调控昆虫生长发育及变态的分子机理,为害虫防治提供理论依据和靶标基因。研究结果与结论本文以鳞翅目夜蛾科的棉铃虫及其表皮细胞系为材料,通过激素调控、RNA干扰、过表达及基因突变等多种方法,深入研究了CKS1和Prodeath S/TK在棉铃虫生长发育、变态及组织解体与重建过程中的功能及作用机理,获得如下结果和结论：1. Prodeath S/TK参与变态期旧组织的程序性细胞死亡Prodeath S/TK在蜕皮和变态期表达水平明显增加,能够被20E诱导上调表达。虫体干扰Prodeath S/TK能够抑制20E信号通路中与细胞凋亡相关的基因表达,导致旧组织解体受到抑制,严重影响昆虫变态的发生。免疫细胞化学实验结果显示,Prodeath S/TK主要是在细胞质中发挥功能,20E诱导不能使其发生亚细胞定位变化。在锦铃虫表皮细胞中过表达Prodeath S/TK能够促使细胞程序性死亡,缺失突变结果显示,S TKc结构域是Prodeath S/TK的功能域,只有当S_TKc结构域定位在细胞质中时,才能够发挥其促细胞程序性死亡的功能,而其N-末端和其C-末端决定了其亚细胞定位。蜕皮激素促进Prodeath S/TK表达,在细胞质中参与20E信号通路来行使其促细胞程序性死亡的功能。2. CKS1通过参与insulin信号通路调控昆虫的生长发育CKS1主要在棉铃虫幼虫生长阶段高表达,在变态期表达水平显著降低。虫体干扰CKS1能够影响insulin信号通路中与生长发育相关的基因表达,延迟生长和变态,形成体型较小的蛹Insulin和20E能够分别上调CKS1的表达水平但两种激素叠加则抑制CKS1表达。在棉铃虫表皮细胞系中过表达的CKS1主要分布在细胞核中,能够促进细胞的增殖,基因突变结果显示CKS结构域行使主要功能,其中的第45位氨基酸N45为其活性位点。虫体干扰CKS1抑制了中肠细胞增殖,进而影响生长所需的营养物质的吸收,使虫体不能达到起始变态所需的临界体重,从而阻碍了幼虫的正常生长和变态的发生。CKS1通过参与insulin信号通路促进生长阶段虫体的细胞增殖,达到临界体重产生高浓度的蜕皮激素,蜕皮激素与insulin(?)叠加终止了CKS1表达和细胞增殖,进入变态。创新点及意义首次鉴定到一种新的蛋白激酶Prodeath S/TK,阐明了该激酶在昆虫变态期通过参与20E信号通路调控旧组织凋亡的分子机理,为20E调控变态期组织解体提供了新的实验证据和理论支持。通过对CKS1(?)的功能研究,揭示了昆早由生长转向变态的分子机理,为insulin参与调控昆虫生长与变态提供了实验依据,阐明了insulin与20E共同作用调控昆虫生长发育的机理。为昆虫发育提供了新的理论知识,为害虫防治提供的新的靶标。