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目的:通过体外诱导小鼠骨髓源树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs）,以及链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）诱导1型糖尿病小鼠模型,探讨晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products,AGEs）对糖尿病小鼠角膜病变中树突状细胞（dendritic cells,DCs）功能的影响及其机制。方法:1.AGEs对小鼠BMDCs功能及下游关键信号通路活化的影响。无菌制备小鼠骨髓单细胞悬液,并用IL-4（10ng/m L）和GM-CSF（20ng/m L）诱导成为BMDCs,然后将其随机分为空白对照（CON）组、BSA组和AGE-BSA组,其中BSA与AGE-BSA均按200μg/m L的浓度分别处理BMDCs 12h和24h。通过酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测IFN-β在上清液内的含量;利用Real-Time PCR（RT-PCR）分析主要炎症相关因子（IFN-β、CXCL10、IFIT1、IL-6、IL-12p35和IL-1β）的表达水平;通过Western blot分析BMDCs中关键信号蛋白TBK1、IRF3和p65的磷酸化水平。2.糖尿病对小鼠角膜内AGEs及炎症因子表达水平的影响。将雄性C57BL/6小鼠（6周）随机分为正常对照（CON）组及糖尿病（diabetes mellitus,DM）组。DM组为通过腹腔注射STZ诱导的1型糖尿病小鼠。选择成模后6个月的DM小鼠及同周龄的正常小鼠眼球,利用Western blot检测两组小鼠角膜内AGEs的表达水平;利用RT-PCR检测两组小鼠角膜内IFN-β等炎症相关因子的表达水平。3.cGAS/STING信号通路在AGEs诱导BMDCs活化中的作用。利用IL-4和GM-CSF体外诱导野生型（wild-type,WT）、cGAS及STING基因缺失型（knockout,KO）小鼠BMDCs,并将不同来源的BMDCs随机分为空白对照组和AGE-BSA组。AGE-BSA处理12h后,分别收集BMDCs与细胞上清液。借助ELISA检测不同组别BMDCs上清液IFN-β的浓度;利用RT-PCR检测不同组别BMDCs炎症因子表达情况;借助Western blot分析cGAS/STING通路下游TBK1、IRF3以及p65的磷酸化水平。4.Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）信号通路在AGEs活化BMDCs中的作用。体外诱导BMDCs,并随机分为空白对照组、AGE-BSA组及TAK-242组（AGE-BSA+TLR4抑制剂TAK-242（5μM））。通过ELISA评估不同组别细胞上清液中IFN-β的浓度;利用RT-PCR检测主要炎症相关因子（同方法1）的转录水平;使用Western Blot分析下游TBK1、IRF3和p65蛋白的磷酸化水平。5.TLR4信号通路抑制剂TAK-242对糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复的影响。将C57BL/6雄性小鼠随机分为以下三组:CON+solvent组（solvent为1%DMSO+99%PBS）、DM+solvent组、DM+TAK-242组（0.375mg/m L）,其中TAK-242于角膜上皮刮除的同时行结膜下注射。使用角膜上皮刮刀和2.5mm环钻刮除小鼠角膜上皮,于刮除后0h、24h和40h行荧光素钠染色照相,并观察角膜上皮愈合的情况。结果:1.AGEs促进BMDCs活化。与CON组及BSA组相比较,AGE-BSA组上清液内IFN-β的浓度明显升高;RT-PCR结果示AGE-BSA可显著上调IFN-β、CXCL10、IFIT1、IL-6、IL-12p35和IL-1βm RNA的表达;Western Blot显示AGEBSA处理后,BMDCs中TBK1、IRF3和p65蛋白磷酸化水平明显增加。以上结果均在AGE-BSA作用后12h最明显。提示AGE-BSA可能通过激活NF-κB和IRF3信号通路活化BMDCs。2.糖尿病引起角膜AGEs沉积及炎症因子表达增加。Western Blot结果显示,与同龄正常小鼠相比,糖尿病小鼠角膜中AGEs蛋白表达水平显著增加。RT-PCR结果示糖尿病小鼠角膜内IFN-β和IFIT1 m RNA表达水平较正常小鼠上调。证实了糖尿病小鼠角膜中AGEs的异常堆积及炎性相关因子的上调。3.AGEs活化BMDCs不依赖于cGAS/STING信号通路。与WT BMDCs相比,AGE-BSA处理的cGAS KO与STING KO BMDCs中,炎性相关细胞因子的表达并未出现下调;Western Blot结果显示,AGE-BSA处理的cGAS KO与STING KO BMDCs中,TBK1、IRF3和p65蛋白的磷酸化水平较WT BMDCs未发生明显变化。以上结果表明AGE-BSA活化BMDCs不依赖于cGAS/STING信号通路。4.AGEs活化BMDCs依赖于TLR4信号通路。ELISA与RT-PCR的结果显示,TAK-242明显抑制IFN-β、CXCL10、IFIT1、IL-6、IL-12p35及IL-1β的表达;Western Blot结果证实TAK-242干预显著降低BMDCs中TBK1、IRF3和p65蛋白的磷酸化水平。以上结果表明AGE-BSA活化BMDCs依赖于TLR4信号通路。5.阻断TLR4信号通路促进糖尿病角膜上皮损伤修复。在角膜上皮刮除后24h和40h,糖尿病小鼠角膜上皮愈合较正常小鼠明显延迟;但TAK-242干预后,可明显促进糖尿病小鼠角膜上皮损伤愈合。以上结果表明TLR4信号通路诱导的炎症反应导致糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复延迟。结论:1.与同龄正常小鼠相比,糖尿病小鼠角膜中存在AGEs异常累积和炎症反应;2.AGEs通过活化DCs中的TLR4信号通路引起糖尿病角膜的慢性炎症反应;3.通过TAK-242阻断TLR4信号通路可促进糖尿病角膜病变上皮损伤修复。