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青礞石(Chloriti Lapis)为常用的矿物类中药,临床可用于治疗癫痫,疗效确切。然而,其治疗癫痫的效应机制及物质基础尚不明确。近年来,本课题组对青礞石成分、质量控制技术、药理作用等方面进行了研究,为课题的开展奠定了基础。本课题从青礞石的治疗病证和自身化学成分入手,结合现代分析技术手段,从药效学、作用机制及物质基础这三个方面对青礞石干预癫痫进行研究。为矿物类中药的基础研究提供思路。主要研究内容如下:1 药效学研究建立戊四氮点燃癫痫大鼠模型,造模成功的大鼠灌胃给予青礞石药材、青礞石药渣及青礞石水煎液。采集大鼠脑组织生物样本,采用HE染色显微观察评价各组大鼠脑组织海马区病变情况,免疫组化法检测海马组织中nNOS蛋白表达,黄嘌呤氧化酶法测定海马中T-SOD活力、硫代巴比妥酸法测定MDA含量、定磷法检测Na+,K+-ATPase及Ca2+,Mg2+-ATPase活性。应用UPLC-QTRAP-MS/MS技术同时测定大鼠脑组织中4种氨基酸。结果显示青礞石粉末、药渣及水煎液组均能降低大鼠海马区的病变程度、提高T-SOD活力、降低MDA含量、升高Na+,K+-ATPase及Ca2+,Mg2+-ATPase活性、降低nNOS的蛋白表达、降低大鼠脑内兴奋性氨基酸递质含量及有效调节皮层及海马区Gly的含量。因此,推测青礞石抗癫痫的机制是增强脑组织的抗氧化活力,清除氧自由基,保护膜功能,维持脑内离子浓度动态平衡,抑制脑部异常放电,在降低兴奋性神经递质含量的同时,又提高了脑内抑制性神经递质含量。2 作用机制研究对戊四氮点燃癫痫大鼠模型给予青礞石粉末,于给药后不同时间取大鼠血样、尿样、及脑组织(末次)样品,样品处理后采用UHPLC-QTOF/MS技术进行定量分析以获得可能多的内源性生物标记物信息,再运用代谢组学数据库,通过多种统计学方法分析差异表达代谢物,确定青礞石对癫痫机体生物标记物的干预情况。最后在血浆和尿液中找到15种差异代谢物:油酸、牛磺酸、亚油酸、肌酸、棕榈酸、脱氢抗坏血酸、LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))、D-丝氨酸、3-甲氧基酪氨酸、左旋肉碱、尿酸、烟酰胺、4-羟基脯氨酸、磷酸丝氨酸、苯乳酸。通过分析得到12个代谢通路,其中比较重要的通路为亚油酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢。在脑组织中找到7种差异代谢物:PS(18:0/18:0)、L-谷氨酸(L-Glutamic acid)、海藻乙醇胺(Docosahexaenoyl Ethanolamide)、花生四烯酸(Arachidonic acid)、葡糖鞘氨醇(Glucosylsphingosine)、胆甾-3,7,12,24,25-五醇(Cholestane-3,7,12,24,25-pentol)、LysoPC(P-18:0)。通过分析得到 12个代谢通路,其中比较重要的通路为D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢、花生四烯酸代谢。通过青礞石干预后,血浆、尿液和脑组织中牛磺酸、脱氢抗坏血酸、3-甲氧基酪氨酸、尿酸、烟酰胺、4-羟基脯氨酸、D-丝氨酸、PS(18:0/18:0)、L-谷氨酸、花生四烯酸、葡糖鞘氨醇、胆甾-3,7,1 2,24,2 5-五醇的含量有显著的调节作用,以上结果表明,青礞石的作用机制可能为:通过调节以上代谢途径,维持脑内离子浓度动态平衡,抑制脑部异常放电;清除氧自由基,增强抗氧化活力,保护膜功能;调节免疫炎症反应,最终达到抑制癫痫的效果。3物质基础研究将造模成功的大鼠给予青礞石后眼眶取血、断头取脑。采用石墨消解样品,运用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)及质谱法(ICP-MS)测定青礞石样品及各组大鼠血浆、脑组织中微量元素的含量,利用SPSS 18.0软件统计分析各金属元素的变化,并进行相关性分析。在血浆中,相对于正常组,模型组大鼠的血浆中Li、Al、Ti、Cr(显著降低)和Mg、K、Sr、Cd(显著上升)8种元素的水平发生显著变化(P<0.05、P<0.01)。通过青礞石作用后,Li、Al显著上升(P<0.05),Sr、Cd显著下降(P<0.05、P<0.01),Cr的含量有往正常方向发展的趋势;在脑组织中,与空白组比较,模型组Zn、Fe、Cu、K、Li、Co、Sn、Pb(显著下降)和Sr、Sb、Ba(显著上升)11种元素的水平发生显著变化(P<0.05、P<0.01)。通过青礞石干预后,Zn、Fe、K、Li、Co、Pb 显著上升(P<0.05、P<0.01),Sr、Sb显著下降(P<0.01),Cu、Ba有往正常水平发展的趋势。另外,与模型组比较,青礞石粉末组Zn/Cu水平发生显著变化;Mg、Ca、Be、Al、Ti、V、Cr、Mn、Ni也有往正常方向发展的趋势。同时,将分析得出的具有显著差异的金属元素分别与血浆和脑组织中筛选出的差异代谢物相关联。结果金属离子中与代谢物关系较为密切的有Fe、Ca、K、Cd、Zn、Co、Sb、Pb、Ti、Li。据此,推测青礞石的物质基础可能与其调节机体微量元素含量有关。