论文部分内容阅读
目的 高血压病是当今世界最严重的社会公共健康复杂疾病之一,能引起一系列严重后果,如心衰、肾衰、心源性休克等。其发病受多种遗传因素和环境因素共同作用,其中遗传因素在高血压的发病机制中起重要作用。随着人类基因组测序的完成,研究与疾病表型的基因序列变异已成为医学遗传学的一个主要课题。单个核苷酸多态(single-nucleotide polymorphism,SNP)作为第三代遗传标记,具有数量大、分布广的特点。系统地在群体水平上筛查鉴定SNPS,特别是编码区和基因调控区的SNPs,通过病例-对照组间的比较和统计学分析,就有可能获得与疾病相关联的SNPs位点或单倍型,这对于阐明某些复杂多基因疾病的遗传机制具有重要意义。WNK4(with no K=lysine kinase)基因是新近分离克隆的一种蛋白激酶基因。该基因第7外显子(exon7)和第17外显子(exon17)突变可导致常染色体显性遗传疾病假性低醛固酮血症(Pseudohypoaldosteronism type Ⅱ,PHAⅡ)。PHAⅡ主要表现为高血钾、代谢性酸中毒和高血压,而且WNK4基因已被定位于血压控制热点区域17q12-21上,因此WNK4基因可能与原发性高血压密切相关。为了阐明WNK4基因与原发性高血压的关系及其在原发性高血压发病机制中的作用,本研究在中国东北汉族高血压高发地区对WHK4基因位于编码区内的两个SNP进行了大样本RFLP筛查。同时对WNK4基因的表达调控机制及其与原发性高血压的关系进行初步研究。 方法 1.通过文献报道和小样本测序确定WNK4基因cSNP,之后进行大样本限制片断长度多态(restricted fragment long polymorphism,RFLP)检测,并对我国东北汉族高血压高发地区人群进行群体病例对照分析研究,探讨cSNP与原发性高血压的相关性。同时根据文献报道比较我国东北汉族人群与欧洲高加索人、非洲人及美国黑人等种族cSNP基因型频率和等位基因频率分布,了解不同种族间WNK4基因cSNP的种族分布差异。 2.RT一PCR方法分析WNK4基因表达谱:Trizol一步法提取胎儿不同组织RNA,以其为模板进行RT一PCR反应分析WNK4基因表达谱。 3.不同处理因素对WNK4基因表达的影响:分别以重组人雌激素、生长激素、胰岛素、地塞米松、血管紧张素n及空白对照处理COS一细胞24小时,Trizol一步法提取细胞RNA,分别进行RT一PCR及Northem杂交检测WNK4基因mRNA表达变化。 4.WNK4基因转录起始点确定:以人肾Marathon cDNA为模板,以5‘Marathon RACE反应确定WNK4基因转录起始点,根据基因组数据库所获得的WNK4基因序列设计3’基因特异性引物(3’GSP),引物序列:5‘TGGGTCTCCATGTCCTCCrl’l,I’r3’。以聚合酶链反应方法在人Marathon cD-NA文库中进行扩增获得对应的cDNA片段,再一次扩增,以前次产物稀释50倍为模板,巢式PCR确定转录起始点。 5.构建WNK4基因启动子pCAT报道表达载体:以基因组DNA为模板,上游引物:5‘CACTGACCTCTCCGTTCGGC3’,下游引物:5’CAGATCAT-TCAGGGCAAAGAC3’,95℃预变性smin,然后按94℃lmin、60℃1而n、72℃lmin3Os进行35个循环,最后72℃延伸10min,扩增WNK4基因启动子序列。PCR产物纯化后,连接到pMD18克隆载体,质粒大量转化并提取质粒,Hindlll和Xbd双酶切,将纯化的酶切产物连接到pCAT载体构建wNK4基因启动子pCAT一WNK4一promoter报道表达载体,测序鉴定证实没有突变发生且符合阅读框架。 6.EMSA方法鉴定WNK4基因启动子区域顺式作用元件及反式作用因子。提取成人肾组织核蛋白并以Bradford比色法测定核蛋白浓度。人工合成含有转录因子API、SPI的双链寡核昔酸序列SA,以T4多核昔酸激酶标记探针后与核蛋白冰浴中连接结合反应,之后8%PAGE凝胶电泳约10小时,放射性自显影。 7.wNK4基因启动子序列G甩的功能鉴定:WNK4基因启动子pCAT-wNK4一promoter报道表达载体转化质粒JM109感受态细胞,无内毒素型超纯质粒DNA提取法提取质粒,酶切鉴定后,脂质体转染法转染COS一细胞,分别以InM,10nM浓度地塞米松处理细胞24小时,同时设置一空白对照,收集细胞,酶联免疫吸附试验(e川守me一hnkedi~unosorbant assay,EllsA)检测CAT蛋白质的表达。结果 1,小样本测序检测到WNK4基因exon7一个新SNP(G1662A),大样本RFLP筛查证实该SNP和另一个位于exons的cSNP(G1816T)的等位基因频率在高血压及正常人群间存在显著性差异,但基因型频率无显著性差异。两者与我国东北汉族高血压发病存在密切相关。同时通过对不同种族人群的对比分析发现我国东北汉族人群WNK4基因exons GI 8 16T多态的基因型频率和等位基因频率与高加索人、非洲人比较差异明显,具有统计学意义(p<0.001),但与美国黑人相近,没有显著性差异(p>0.05)。 2.WNK4基因表达谱分析结果显示WNK4基因在胎儿肾脏有高强度表达,在脑、肺、心、脾、肠等组织中有表达,但在肝组织中却无表达。 3.以重组人生长激素(hGH,终浓度为6IunoFL)、重组人雌激素(p一EZ,终浓度为1林m0FL)、血管紧张素n(Angn,终浓度为5林m0FL)、地塞米松(Dexamethson,终浓度为1 nmoFL)及?