2019冠状病毒病（COVID-19）目前已经成为迄今为止规模最大的一场全球大流行,根据WHO的报道,截至北京时间2021年4月19日晚上10点28分,全球共有141,057,106确诊病例,其中3,015,043死亡病例。其病原体为一种新型的冠状病毒（SARS-CoV-2）。与其他病毒相比,SARS-CoV-2引起的天然免疫应答较弱。因此从分子水平上研究SARS-CoV-2与宿主天然免疫之间的相互拮抗作用,对进一步明确病毒的致病机制十分重要。为了从病毒角度了解SARS-CoV-2拮抗宿主天然免疫的具体机制,我们首先构建了 SARS-CoV-2病毒编码的23个蛋白的表达质粒,在HEK293T细胞上验证了各蛋白表达之后,利用双荧光素酶报告系统,检测了各个病毒蛋白对IFN信号通路中重要蛋白RIG-IN、MDA5和TRIF所诱导的IFN-β启动子激活的影响。结果发现nspl、nsp3、nsp12、nsp13、nsp14、ORF3、ORF6 和 M 等多个病毒蛋白在 RLR 或TLR信号通路中发挥抑制作用。本论文中我们聚焦于SARS-CoV-2的RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）nsp12,对其抑制I型IFN信号的作用机制进行了初步的探索。我们首先确定了 nspl2可以抑制SeV或转染高分子量（HMW）poly（I:C）所诱导的内源IFN-βmRNA的表达,随后通过双荧光素酶报告体系,确认了 nsp12以剂量依赖的方式抑制SeV或转染HMW poly（I:C）所诱导的IFN-β启动子的激活,通过检测IFN-β下游ISRE启动子活性,发现nsp12对于外源IFN-β处理所刺激的ISRE启动子的活化没有显著影响。以上结果提示nsp12抑制IFN-β的上游信号通路而不抑制IFN-β的下游。接下来我们通过检测RIG-IN、MDA5、MAVS和IRF3-5D所诱导的IFN-β启动子的激活,发现nsp12对以上4个分子下游信号的活化都有抑制作用,说明nsp12的作用靶点在IRF3或其下游。随后我们检测了 nsp12对SeV刺激的IRF3活化的影响,发现nsp12并不影响IRF3的磷酸化。co-IP实验发现nsp12与IRF3也没有直接的相互作用。通过核质分离和免疫荧光实验发现,nsp12可以抑制SeV或RIG-IN刺激的IRF3的入核,说明nsp12是通过抑制IRF3入核而拮抗IFN-β的产生。为了验证nsp12拮抗IFN-β的产生是否与其聚合酶的活性有关,我们将nspl2聚合酶活性关键位点进行了突变,发现聚合酶活性位点突变后的nsp12仍然能抑制SeV诱导的IFN-β启动子的激活和IRF3的入核。在nspl2酶活抑制剂瑞德西韦（Remdesivir）存在时,nsp12依然能抑制IRF3-5D下游信号的激活。同时,nsp12辅助因子nsp7和nsp8的存在与否也不影响nspl2拮抗I型IFN的能力。以上实验结果证明了 nspl2拮抗IFN-β的产生是聚合酶活性非依赖的。另外,我们从宿主抗病毒的角度出发,通过干扰素刺激基因（ISG）敲除细胞筛选以寻找能够抑制SARS-CoV-2病毒复制的关键宿主因子。通过前期的筛选,我们发现LGALS9基因（编码蛋白Galectin-9,Gal-9）缺失的A549-ACE2或THP-1细胞中SARS-CoV-2病毒复制明显增强,同时在过表达Gal-9的细胞中病毒复制明显被抑制。我们首先检测到Gal-9可以抑制SARS-CoV-2复制子活性。随后通过体外co-IP 实验,我们发现 Gal-9 能够与 SARS-CoV-2 的 nsp2、nsp8、nspl2 和 nspl6 这几个参与病毒基因组复制的关键蛋白相互作用。以上结果说明Gal-9可以抑制SARS-CoV-2的复制过程。此外,我们还检测了 Gal-9对其他病毒复制的影响,结果发现在LGALS9敲除的细胞中,另外一种重要的单股正链RNA病毒肠道病毒的复制也明显增强。在过表达Gal-9的细胞中,肠道病毒复制也显著降低。我们通过比较病毒感染早期时间点的RNA和蛋白差异,发现Gal-9可能影响病毒感染的早期阶段。在细胞内直接转染病毒基因组时,发现LGALS9敲除的细胞中病毒RNA的复制明显增强,说明Gal-9也可以抑制肠道病毒的复制。综上所述,首先,本研究发现了 SARS-CoV-2的多种病毒蛋白有直接抑制Ⅰ型IFN信号的作用,其中病毒聚合酶nspl2能够通过抑制IRF3的入核来抑制Ⅰ型IFN的产生,而这种抑制作用不依赖于病毒本身的聚合酶活性。其次,本研究还发现干扰素刺激基因Gal-9能够抑制SARS-CoV-2的复制,而且与nsp12等病毒蛋白直接结合,Gal-9也能够抑制肠道病毒病毒基因组的复制。