阿尔兹海默病(Alzheimers disease, AD)是一种严重的中枢神经系统退行性疾病,主要临床表现为进行性的认知功能减退,预后不良,患者一般死于肺栓塞和继发感染。阿尔兹海默病常散发,其临床发病率女性是男性的1.5～3倍。神经病理学特征主要包括β样淀粉样蛋白(β3-amyloid protein, Aβ)沉积形成的细胞外老年斑(senile plaque, SP)、tau蛋白的过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结以及神经元的丢失伴随着胶质细胞的增生等。其中不溶性淀粉样蛋白杂乱无序的聚集被认为是AD发生发展的关键环节。淀粉样蛋白淀粉样前体蛋白(amyloid precusor protein, APP)水解产生：正常情况下,淀粉样前体蛋白主要被α-水解酶水解生成s-APPα和C-端片段C83,这两种水解产物均可通过正常途径代谢；而在AD大脑中,淀粉样前体蛋白则主要由β-水解酶水解生成β-APP多肽和C-端片段C99,随后产物被γ-分泌酶水解生成一些长度为36-43个氨基酸的不溶性片段,即Aβ。Aβ1-42是淀粉样蛋白最常见的形式之一,也是形成不溶性淀粉样蛋白聚集的主要分型之一,与AD疾病的发生发展密切相关。人脑中α-分泌酶的主要类型是解整合素样金属蛋白酶(α-secretase a disintegrin and metallopeptidase domain10, ADAM10)和ADAM17,而分布于神经元中的主要是ADAM10;β-分泌酶的主要类型是β位淀粉样前体蛋白裂解酶-1(β-site-APP cleavage enzyme-1, BACE-1),另一种类型BACE-2在神经系统中分布较少。研究发现,AD患者大脑中α-分泌酶较正常大脑分泌减少,而β-分泌酶则分泌增多或者活性增强,这一改变影响淀粉样前体蛋白的水解过程,引起AD患者Aβ异常增多。雌激素与女性AD密切相关。研究发现女性绝经后记忆障碍的出现较较绝经前明显增多,另外的研究也证实女性绝经后雌激素水平的降低是AD发病的高风险因素之一。研究发现,绝经后的妇女使用激素替代疗法(estrogen replacement therapy, ERT)能够明显推迟甚至阻止AD的发生。雌激素影响AD发生发展的确切机制尚不明确,但研究发现雌激素能够通过调节体外培养的神经元和胶质细胞的淀粉样前体蛋白水解过程来减少Aβ的产生,并且,雌激素已被证实在缺血休克和包括AD在内的许多神经退行性疾病中发挥着神经保护作用,提示雌激素可能通过影响淀粉样前体蛋白水解过程及其神经保护作用发挥抗AD的作用。然而,临床研究发现,雌激素替代疗法有着不可忽视的副作用。比如有研究发现使用雌激素替代疗法的女性患者患子宫内膜癌和乳腺癌的风险明显增加。因此,亟需寻找一种有效且安全的替代疗法,而人参皂苷Rg1有可能符合这一要求而替代雌激素。人参皂苷Rg1是从中药人参中提取的中药有效单体之一,其分子式为C42H72O14,分子量为801.01,具有水溶性,且易溶于甲醇、乙醇。依据大样本的临床研究,人参皂苷Rg1是安全的植物雌激素,并不能带来当前药用雌激素所引起的生殖系统癌症高发病率的风险。有研究发现,人参皂苷Rg1与雌激素在诸如抗氧化、抑制凋亡等方面具有类似的功效,并且两者的上述作用均是是通过胰岛素样生长因子受体(insulin-like growth factor receptor, IGF-IR) I途径和雌激素受体(estrogen receptor, ER)途径实现的。此外,人参皂苷Rg1还可能影响Aβ的生成与代谢过程。由此可见,人参皂苷Rg1可能作为雌激素的替代疗法。本研究中,我们首先探讨了利用去卵巢结合D-半乳糖腹腔注射建立大鼠AD模型的可行性,发现去卵巢结合D-半乳糖腹腔注射处理的大鼠行为学改变以及海马病理学改变均符合AD疾病情况下的变化,提示造模成功。然后,我们研究了人参皂苷Rg1对AD大鼠模型学习和记忆的影响。机制方面,主要研究了AD模型大鼠海马中ADAM10和BACE1的改变情况,以明确人参皂苷Rg1对淀粉样蛋白水解过程的影响。同时,我们还研究了活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶caspase3的变化情况,以明确人参皂苷Rg1对AD模型大鼠神经元凋亡的影响。目的本实验研究首先验证利用去卵巢手术联合D-半乳糖腹腔注射建立大鼠AD模型的可行性。然后,以雌激素为对照,观察人参皂苷Rg1对AD大鼠模型记忆功能障碍的改善作用,并进一步探讨其作用机制。方法1.研究对象及分组：将96只Wistar大鼠随机分为两组,一组72只行去卵巢手术,另一组24只行假手术,术后行抗炎处理。将假手术组大鼠随机等分为两组：一组按1ml/kg/d在大鼠腹部皮下注射生理盐水(CT),另一组按100mg/kg/d腹腔注射D-半乳糖(D)；去卵巢手术组大鼠随机等分为六组：第一组按1ml/kg/d的剂量在去卵巢手术大鼠的腹部皮下注射生理盐水(O),第二组的去卵巢大鼠同时注射D-半乳糖(O+D),第三组是腹腔注射D-半乳糖的去卵巢大鼠按100μg/kg/d的剂量在皮下注射雌激素(O+D+E),第四组是腹腔注射D-半乳糖的去卵巢大鼠腹腔注射5mg/kg/d剂量的人参皂苷Rgl,为人参皂苷低剂量处理组(O+D+L),第五组是腹腔注射D-半乳糖的去卵巢大鼠腹腔注射中剂量的,即10mg/kg/d的人参皂苷Rg1(O+D+M),第六组是腹腔注射D-半乳糖的去卵巢大鼠用高剂量即腹腔注射20mg/kg/d的人参皂苷Rgl(O+D+H)。所有液体均按照每天需要注射的剂量稀释,以使每天为大鼠注射的液体量保持在300μl左右,用药6周。2.研究内容：(1) Morris水迷宫实验检测各组大鼠的空间学习与记忆的能力;(2)Elisa实验检测各组大鼠海马组织中Apl-42的含量；(3)免疫组织化学法检测各组大鼠海马细胞中ADAM10和BACE1勺表达情况；(4)实时定量PCR检测大鼠海马中ADAM10、BACE1、caspase3mRNA的表达情况；(5) Western blot检测大鼠海马中ADAM10、活化的caspase3蛋白的表达情况。结果1.去卵巢结合D-半乳糖腹腔注射能够显著损害大鼠的认知功能,引起大鼠海马内Aβ1-42的高表达。(1)造模后各组大鼠Morris水迷宫的实验结果：通过水迷宫实验,我们发现去卵巢术、D-半乳糖的腹腔注射都能够明显延长大鼠寻找平台的潜伏期时间(P<0.05),而去卵巢术结合D-半乳糖腹腔注射组大鼠的潜伏期时间最长,较前两者的差异有显著性(P<0.05)。而且,卵巢切除术、D-半乳糖的腹腔注射都能够明显降低大鼠第七天穿越平台的次数,而卵巢切除术结合D-半乳糖腹腔注射组大鼠的第七天平均穿越平台的次数最少,其中,两者结合组的平均穿越平台数是对照组的40%,约是卵巢切除术后组、D-半乳糖腹腔注射组的70%。(2)造模后各组大鼠海马中Aβ1-42的浓度测定：Elisa的实验结果显示去卵巢术结合D-半乳糖的腹腔注射能够显著提高大鼠海马中Aβ1-42的水平(P<0.05),较对照组提高了约110%,而卵巢切除术、D-半乳糖的腹腔注射则具有相对较弱的作用。2.人参皂苷Rg1和雌激素能够显著改善模型大鼠的学习和记忆能力(1)各组大鼠Morris水迷宫的实验结果：使用人参皂苷Rg1和雌激素处理的各组大鼠,都明显减少了造模所引起的潜伏期延长(P<0.05)。三种不同剂量人参皂苷的处理组中,中剂量和高剂量人参皂苷Rg1处理组的大鼠在缩短平均潜伏期方面明显优低剂量组(P<0.05)。同时,各组大鼠的游泳速度没有显著变化,证明了各种处理因素没有明显影响大鼠的运动能力。并且,使用人参皂苷Rg1和雌激素治疗的大鼠都能有效防止造模所引起的大鼠穿越平台次数的减少,治疗后的大鼠穿越平台数目明显增多(P<0.05)。而且与学习阶段所得到的结果一致,中剂量和高剂量的人参皂苷Rgl处理组的大鼠穿越平台的次数明显多于低剂量组(P<0.05)。(2)各组大鼠海马中Aβ1-42的浓度测定：人参皂苷Rg1和雌激素的处理,都能够不同程度地降低大鼠海马中Ap1-42的含量(P<0.05),其中,模型组大鼠海马中Aβ1-42的含量是正常大鼠的2.2倍,中剂量的人参皂苷Rg1降低到模型大鼠海马中Aβ1-42含量的63%,高剂量处理组则降低到约69%,而低剂量只降低到造模组含量的85%,这说明中剂量和高剂量的治疗效果明显优于低剂量组。3.人参皂苷Rg1和雌激素促进模型大鼠学习和记忆能力的机制研究(1)各组大鼠海马中ADAM10和BACE1的阳性细胞表达情况：免疫组化的结果显示,在对照组大鼠的海马中ADAM10的阳性细胞率为67.4%±1.78%,而造模大鼠(O+D)的海马中ADAM10阳性细胞率仅为12±1.53%(P<0.01)。用人参皂苷和雌激素处理后,低剂量人参皂苷Rg1组海马中阳性细胞率为29.9±1.52%,中剂量人参皂苷Rg1处理组的阳性细胞率为66.45%4±1.55%,高剂量人参皂苷Rg1处理组的阳性细胞率为50.3%±4.67%,雌激素处理组的阳性细胞率为50.3±4.67%。关于BACE1,造模组中BACE1阳性神经元率为62.3%±1.55%,使用人参皂苷Rg1和雌激素处理后,中剂量人参皂苷Rg1处理后BACE1阳性细胞率为19.34%±1.03%,高剂量的Rg1处理后为25.13%±1.13%,雌激素处理后阳性细胞率则降为25.89%+1.42%(P<0.05)。(2)实时定量检测大鼠海马中ADAM10、BACE1(?)(?)cawspase3的表达情况：结果显不,ADAM10的表达在造模组中明显减少(P<0.05),人参皂苷Rg1和雌激素能够明显改变造模大鼠的这种ADAM10的减少情况(P<0.05)。并且数据显示,中剂量的人参皂苷Rg1组的ADAM10mRNA水平是造模组的1.8倍,高剂量的人参皂苷Rg1组的是造模组的1.6倍,而低剂量组ADAM10的基因水平仅为造模组的1.1倍,这说明中高剂量的人参皂苷Rg1的治疗效果明显优于低剂量的人参皂苷。而关于BACE1的表达情况,去卵巢结合D-半乳糖能够明显促进大鼠海马中BACE1的表达,人参皂苷Rg1和雌激素的处理都能够明显抑制造模引起的这种作用,且中剂量和高剂量组在降低BACE1的表达方面明显优于低剂量组。(3) Western blot实验检测ADAM10和caspase3的表达情况：蛋白印迹的实验结果以及对其进行的光密度分析显示ADAM10在海马中的表达因造模急剧下降,且人参皂苷Rg1和雌激素的处理都能够明显升高因造模而降低的ADAM10的表达水平(P<0.05)。而关于凋亡因子的表达情况,造模组大鼠海马组织中活化的caspase3水平明显升高(P<0.05),人参皂苷Rg1和雌激素的治疗都能够明显降低活化的casapse3的水平(P<0.05)。其中,中剂量的人参皂苷Rg1处理的大鼠活化的casapse3水平是造模组的53%,高剂量处理组活化的casapse3的水平是造模组的51%,而低剂量的人参皂苷Rg1处理后活化的casapse3水平仅降为造模组的87%,说明中剂量和高剂量的人参皂苷Rg1在降低活化的caspase3的效果方面明显优于低剂量组。结论1.卵巢切除术结合D-半乳糖腹腔注射组大鼠在行为学改变和海马组织的病理改变均符合AD的特征,表明卵巢切除术结合D-半乳糖腹腔注射可以用于模拟AD。2.人参皂苷Rg1能够明显地改善利用去卵巢结合D-半乳糖腹腔注射建立的AD大鼠模型的认知功能障碍。3.人参皂苷Rg1对AD大鼠模型学习和记忆能力的改善作用可能是通过调节淀粉样前体蛋白水解过程及其神经保护作用来实现的。