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癫痫(epilepsy,EP)是由多种原因引起脑部神经元同步化异常放电所致短暂性脑功能障碍的临床综合征。癫痫发作严重影响着患者的生活和工作,也给家庭及社会带来了较大的负面影响。尽管各种新型抗癫痫药物为广大患者带来希望,但仍有1/3患者规律合理服药后癫痫未得到有效控制,为药物难治性癫痫。癫痫发病机制的复杂性和不确定性是难治性癫痫的根本原因,故而深入研究癫痫的发病机制、探求新的诊治靶点具有重要现实意义。 线粒体是细胞有氧呼吸、能量生成和传递细胞死亡信号的双层膜包被的重要细胞器,被称为细胞的“能量工厂”。研究证实其不仅通过氧化磷酸化途径为细胞生命活动提供能量,而且参与细胞代谢和信号的传导、钙离子稳态调节、活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生及细胞凋亡等过程。近年来线粒体在癫痫神经损伤中的作用愈加引起关注,线粒体功能障碍及质量控制系统的失衡可能在癫痫神经元损伤中发挥重要作用。 线粒体是细胞内重要的钙离子贮存库,近年研究发现线粒体钙离子(Calcium,Ca2+)稳态失衡在癫痫发作诱导的神经损伤中起重要作用。线粒体钙单向转运蛋白(Mitochondrial calcium uniporter,MCU)是线粒体内膜上摄取钙离子的选择性钙通道,其摄取钙离子依赖线粒体内膜电势,钙离子顺电化学梯度扩散,在维持线粒体乃至细胞钙稳态中发挥重要作用。癫痫发作时MCU通过摄取大量涌入胞浆的Ca2+以维持细胞内环境稳态,发挥线粒体代偿作用;但过量的Ca2+进入线粒体基质,可导致ROS生成增加,触发线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore,mPTP)的开放和促凋亡因子如细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)、活化半胱天冬酶(Caspase)的释放,进而促进细胞凋亡。目前研究发现抑制MCU活性可降低大鼠脑缺血侧线粒体内游离钙离子的含量,提高ATP含量,并通过抑制线粒体分裂减轻线粒体损伤,从而缓解缺血再灌注脑损伤。并发现MCU在高血压、蛛网下腔出血脑损伤和糖尿病心肌病发病机制中具有重要调控作用。我们前期研究发现MCU在癫痫大鼠模型海马神经损伤中发挥重要作用,但其具体作用机制仍有待进一步阐明。 目的: 本研究采用无镁细胞外液处理原代大鼠海马神经元建立急性癫痫体外细胞模型,并通过观察内质网应激蛋白(glucose regulating protein78,GRP78)和CHOP(C/EBP homologous protein,CHOP)的表达,探讨MCU抑制剂Ru360及激动剂Spermine对无镁致痫大鼠海马神经元内质网应激及凋亡的影响,并分别通过Mito Q及CHOP siRNA干预进一步探讨其作用机制。 方法: 将新生24h以内的健康SD大鼠乳鼠在75%酒精中浸泡消毒,断头处死,取出双侧大脑、放入盛有预冷PBS缓冲液的培养皿中,暴露剥离海马组织,剔除表面血管膜,用眼科剪将海马剪成小组织块,胰酶消化、胎牛血清培养基终止消化、200目细胞筛滤过,最终制成单细胞悬液。调整细胞浓度种植于细胞培养板,体外进行海马神经元原代培养,进行海马神经元细胞纯度测定。培养10天后进行随机分组,分为CON组、AE组、AE+Ru360组、AE+Spermine组四组,用无镁细胞外液处理3h后恢复至正常细胞培养液。AE+Ru360组、AE+Spermine组在无镁细胞外液处理前30min分别给予Ru360和Spermine预处理。通过MTT比色法测定神经元细胞活性,采用TUNEL法检测神经元损伤和凋亡情况。另选各组细胞提取总蛋白,使用Western blot法检测GRP78和CHOP表达水平,并进一步应用Mito Q、CHOP siRNA干预研究ERS与ROS之间的关系。 应用SPSS17.0统计分析,得到的数据用均数±标准差((x)±s)表达。采用单因素方差分析和LSD(Least-Significant Difference)-t检验的方法比较各组癫痫海马神经元活性、线粒体钙浓度、线粒体ROS生成水平和内质网应激蛋白表达水平的差异,P<0.05表示差异有统计学意义。 结果: 1、神经元纯度检测显示海马神经元纯度为92%以上。 2、MTT比色法检测原代培养海马神经元活性发现,与AE组比较,Ru360组海马神经元细胞活性明显升高,而Spermine组作用相反。 3、TUNEL染色检测凋亡细胞发现,与AE组相比,Ru360明显减少海马神经元细胞凋亡,而Spermine组作用相反。 4、钙离子荧光探针Rhod-2/AM与线粒体荧光探针Mito SOX检测发现,与AE组相比,Ru360组明显降低线粒体钙离子浓度和线粒体ROS生成水平,而Spermine组作用相反。 5、Western blotting检测发现,与AE组相比,Ru360减少了GRP78和CHOP表达水平的升高,而Spermine作用相反。 6、Mito Q干预明显降低了癫痫海马神经元线粒体ROS生成水平,并且MitoQ预处理可降低GRP78和CHOP表达水平。 7、CHOP siRNA干预明显缓解海马神经元细胞损伤。 结论: 1、抑制MCU减少了癫痫发作诱导的ERS及细胞凋亡。 2、ROS介导的ERS可能在MCU参与癫痫海马神经元凋亡过程中发挥重要作用。