【研究背景】人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）感染在全世界普遍存在,人群血清阳性率在40%至90%以上。在免疫正常个体,绝大多数为无症状感染,但在免疫抑制或缺陷个体,易发生HCMV相关性疾病。例如,HCMV视网膜炎主要发生于无法对病毒产生正常T细胞免疫反应患者,或者是由于疾病或免疫抑制治疗而使HCMV特异性T细胞免疫反应降低者,如获得性免疫缺陷综合症（Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS）和白血病患者。细胞自噬在病毒感染中起着双重作用,不仅可以调节主要的抗病毒应答,防止长期和过度的炎症反应,还可通过控制病毒感染而最终清除病毒。研究发现,细胞自噬在巨细胞病毒（CMV）感染早期可被诱发,并对病毒复制和宿主细胞的存活产生影响,而病毒可通过自身编码的蛋白与细胞自噬相关蛋白相互作用来限制自噬及其诱导的相关抗病毒免疫反应,进而有利于病毒长期潜伏于宿主细胞。然而,关于CMV感染如何诱发自噬以及自噬又如何影响病毒复制等机制迄今仍不十分清楚,值得进一步深入研究。HCMV基因p UL83编码的磷酸蛋白pp65是病毒颗粒中含量最丰富的蛋白,参与病毒基因转录和病毒复制。HCMV即刻早期基因1和2编码的即刻早期蛋白IE1（Immediately early 1 protein）和IE2（Immediately early 2 protein）对于病毒急性感染的建立和潜伏感染的再激活都至关重要。然而,IE1并非是病毒复制完全必不可少因子,而IE2对于病毒复制则是完全必需。因此,明确细胞自噬是否对病毒IE2表达有一定调控作用以及IE2在HCMV诱发细胞自噬中的作用,将有助于理解自噬与HCMV复制之间的复杂关系,亦有可能为限制病毒复制策略提供潜在作用靶点。为此,本研究的第一部分将利用人胚肺成纤维细胞（Human embryonic lung fibroblasts,HELs）和人白血病单核细胞（THP-1）诱导分化的巨噬细胞为体外模型,首先探讨病毒蛋白IE2与HCMV感染诱发细胞自噬过程中的相互作用;其次通过自噬诱导剂雷帕霉素（Rapamycin）和抑制剂3-MA分别于HCMV进入细胞之前和/或之后进行干预性调控细胞自噬水平来研究其对病毒蛋白IE2和p UL83表达的影响。细胞凋亡是宿主清除急性期病毒感染的另一个重要机制。然而,病毒编码的诸多蛋白可通过抑制凋亡通路中关键蛋白的表达来抑制细胞凋亡过程,从而抑制宿主细胞对病毒的清除。自噬与凋亡之间也存在复杂的相互调控作用,进而对病毒基因的复制产生影响。且在AIDS和白血病患者中常见的巨细胞病毒视网膜炎导致失明的最主要原因是感光细胞和视网膜色素上皮细胞发生坏死。小鼠巨细胞病毒（Murine cytomegalovirus,MCMV）与HCMV在基因组和致病机制方面有极大的相似性,因而常常利用MCMV小鼠体内外模型来研究HCMV致病机制。MCMV早期抗原（Early antigen,EA）是一种病毒中含量丰富的核蛋白,其表达水平可以反映病毒的复制水平。本研究的第二部分主要通过MCMV体外感染小鼠胚肺成纤维细胞（Mouse embryo lung fibroblast cells,MEF）和眼睛后半球（Eyecup）组织模型来进一步研究自噬诱导剂Rapamycin和抑制剂3-MA及氯喹（Chloroquine,CQ）对MCMV病毒复制的作用,并进一步探讨Caspase-3介导的细胞凋亡以及RIPK1/RIPK3/MLKL介导的细胞程序性坏死是否参与自噬调控病毒复制的机制。【研究目的】1.探讨病毒即刻早期蛋白IE2表达在HCMV感染引发自噬状态改变中的作用;2.研究不同时间点和不同方式调控自噬水平对HCMV病毒蛋白尤其是即刻早期蛋白IE2表达的影响;3.利用小鼠眼睛后半球（Eyecup）组织培养模型进一步探讨在MCMV感染过程中不同自噬水平对病毒复制的影响;4.分析Caspase-3介导的细胞凋亡以及RIPK1/RIPK3/MLKL通路介导的细胞程序性坏死在自噬调控MCMV复制中的作用;5.进一步通过另一自噬抑制剂CQ证实自噬对MCMV病毒复制的影响,并探讨Caspase-3介导的细胞凋亡在CQ调控MCMV病毒复制中的作用,进而为抗病毒治疗提供可能的靶点和新的思路。【研究方法】1.自噬对人巨细胞病毒相关蛋白表达的影响1.1检测HCMV感染后自噬水平变化以及病毒IE2蛋白是否参与调控自噬1)HCMV AD169毒株或DMEM模拟感染人胚肺成纤维细胞（HELs）和THP-1诱导分化的巨噬细胞,感染复数（MOI）=1);于感染后6小时（h）、12h、24h和48h提取总蛋白;2)通过脂质体lipofectamine 3000转染编码病毒即刻早期蛋白IE2的UL122重组质粒,使IE2在HELs中过表达,于转染后24h提取总蛋白;3)蛋白免疫印迹试验（Western blot,WB）检测自噬标志物LC3I/II和SQSTM1/p62、自噬相关蛋白ATG3、病毒蛋白IE2和p UL83表达水平;4)Image J分析各目的蛋白相对表达水平并进一步组间对比分析。1.2调控自噬水平对病毒蛋白IE2和p UL83表达的影响1)实验分组:设立DMEM模拟干预和模拟感染组、DMEM模拟干预HCMV感染组、3-MA+DMEM模拟感染组、3-MA+HCMV感染组、Rapamycin+DMEM模拟感染组和Rapamycin+HCMV感染组;2)病毒感染前预处理:使用自噬诱导剂Rapamycin（500n M）和抑制剂3-MA（5m M）预处理细胞24h以诱导或抑制自噬,随后换液,并用HCMV AD169毒株（MOI=1）感染HELs及THP-1诱导的巨噬细胞,分别于HCMV感染后24h和48h提取细胞总蛋白;3)病毒感染后处理:在HCMV AD169毒株（MOI=1）感染HELs及THP-1诱导的巨噬细胞2h之后,换液时加入自噬诱导剂Rapamycin（500n M）和抑制剂3-MA（5m M）诱导或抑制自噬,并分别于HCMV感染后24h和48h提取细胞总蛋白;4)WB测定LC3I/II、SQSTM1/p62和ATG3以及病毒蛋白IE2和p UL83表达水平;5)于HCMV感染HELs后48h,免疫荧光染色检测病毒蛋白IE1在细胞的分布和表达水平;6)采用Image J分析各目的蛋白的相对表达水平及各组IE1表达的荧光强度,并进一步进行组间对比分析。1.3 si RNA沉默ATG3表达对病毒蛋白IE2表达的影响1)ATG3特异性si RNA由武汉擎科生物科技有限公司合成;2)通过脂质体lipofectamine 3000将ATG3特异性si RNA或空白对照si RNA瞬时转染至HELs,于转染后24h感染HCMV病毒（MOI=1）或DMEM模拟感染HELs;3)HCMV感染后12h和24h提取细胞总蛋白,WB测定ATG3和LC3I/II及病毒蛋白IE2表达水平;4)采用Image J分析各组各目的蛋白相对表达水平。1.4 Rapamycin、3-MA及si ATG3调控自噬水平对HCMV诱导细胞凋亡的影响1)实验分组:同上1.2和1.3;2)分别于HCMV感染HELs（MOI=1）前和后给予自噬诱导剂Rapamycin（500n M）和抑制剂3-MA（5m M）处理;3)ATG3特异性si RNA或空白对照si RNA瞬时转染至HELs,于转染后24h感染HCMV病毒（MOI=1）或DMEM模拟感染HELs;4)于HCMV感染后24h及48h收集细胞悬液,采用PE Annexin V 7-AAD染色流式上机检测细胞凋亡水平。2.自噬对小鼠巨细胞病毒（MCMV）复制的影响及其机制研究2.1 MCMV感染对自噬及细胞凋亡水平的影响1)组织和细胞感染模型:从成年C57BL/6J小鼠中分离出小鼠眼睛后半球（Eyecup）组织进行培养,并感染MCMV K181株（5×10~3PFU）或给予DMEM模拟感染;取小鼠胚肺成纤维细胞（MEF）感染MCMV K181毒株（MOI=0.1）或使用DMEM模拟感染;2)MCMV感染Eyecup后第4天（4d）、第7天（7d）、第10天（10d）和第14天（14 d）,以及MEF细胞感染MCMV后24h和48h提取总蛋白;3)WB检测LC3I/II和SQSTM1/p62、磷酸化-p70 S6激酶（T389）（Phospho-p70S6 kinase）、以及活化的Caspase-3（Cleaved caspase-3）蛋白表达水平,用Image J分析各目的蛋白的相对表达水平;4)于MEF感染MCMV后48h,进行Cleaved caspase-3或磷酸化MLKL（p MLKL）与TUNEL双重免疫荧光染色,确定TUNEL阳性细胞与Cleaved caspase-3或p MLKL表达的位置关系。2.2自噬诱导剂Rapamycin和抑制剂3-MA对MCMV病毒复制的影响1)实验分组:设立DMEM模拟感染和模拟干预组、MCMV感染组、3-MA+MCMV感染组和Rapamycin+MCMV感染组;2)用MCMV K181毒株分别感染MEF及分离培养的Eyecup组织,前者感染病毒量为MOI=0.1,后者为5×10~3PFU;3)按照不同分组分别于细胞或组织感染病毒2h后换液时给予Rapamycin（500n M）、3-MA（5m M）或DMEM模拟处理;4)分别于MEF感染后24h、48h、72h和96h,以及Eyecup感染后4d、7d、10d及14d后收集培养上清,采用蚀斑试验检测MEF和Eyecup培养上清中病毒滴度;5)MCMV感染MEF 48h后固定细胞,用免疫荧光染色检测自噬诱导剂Rapamycin和自噬抑制剂3-MA处理后病毒早期抗原EA表达水平;6)分别于MCMV感染Eyecup后4d、7d、10d及d14,采用免疫荧光染色检测自噬诱导剂Rapamycin和自噬抑制剂3-MA处理的Eyecup冰冻切片以及整个Eyecup平面直接染色中的病毒早期抗原EA表达水平;7)用Image J进行MEF细胞和Eyecup中EA表达的荧光强度分析,并进行组间比较。2.3 Caspase-3介导的细胞凋亡在自噬调控MCMV复制中的作用1)实验分组和病毒感染:设立DMEM模拟感染和模拟干预组、MCMV感染组、3-MA+DMEM模拟感染组、3-MA+MCMV感染组、Rapamycin+DMEM模拟感染组和Rapamycin+MCMV感染组,病毒感染同上2.2;2)按照不同分组分别于细胞或组织感染病毒2h后换液时给予Rapamycin（500n M）、3-MA（5m M）或DMEM模拟处理;3)自噬诱导剂Rapamycin（500n M）和抑制剂3-MA（5m M）的细胞毒性检测:分别于Rapamycin（500n M）,3-MA（5m M）或DMEM培养基模拟处理Eyecup后7d,以及3-MA（5m M）或DMEM培养基模拟处理MEF后48h进行TUNEL染色,检测其化学药物本身对MEF和组织细胞死亡的影响;4)分别于MCMV感染Eyecup后4d、7d及14d进行视网膜色素上皮细胞（Retina pigment epithelial cells,RPE）与TUNEL双重免疫荧光染色,以及MCMV感染Eyecup后7d和MEF后48h进行TUNEL与MCMV EA的双重免疫荧光染色,检测不同处理组的死亡细胞分布情况和EA表达水平;5)于Eyecup感染病毒后4d、7d、10d及14d提取组织总蛋白,以及MEF感染病毒后24h和48h提取细胞总蛋白,WB检测LC3I/II和SQSTM1/p62、以及Phospho-p70 S6 kinase（T389）、m TOR、磷酸化m TOR（pm TOR）、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8以及细胞程序性坏死通路RIPK1/RIPK3/MLKL蛋白表达水平;6)采用Image J分析Eyecup和MEF中TUNEL和EA阳性细胞数量,以及使用Image J分析各目的蛋白的相对表达水平。2.4自噬抑制剂氯喹（CQ）在MCMV诱导细胞凋亡及病毒复制中的作用1)实验分组:DMEM模拟感染组、MCMV感染组、Rapamycin+MCMV感染组、3-MA+DMEM模拟感染组、3-MA+MCMV感染组、CQ+DMEM模拟感染组、CQ+MCMV感染组;2)MCMV K181毒株感染MEF和Eyecup,感染病毒量分别为MOI=0.1（MEF）和5×10~3PFU（Eyecup）;3)按照不同分组分别于细胞或组织感染病毒2h后换液时给予Rapamycin（500n M）、3-MA（5m M）、CQ（100μM）或DMEM模拟处理,并于MCMV感染MEF后48h以及感染Eyecup后第7d收集细胞或组织培养上清,通过蚀斑实验检测MCMV病毒滴度;4)分别于MCMV感染MEF后24h和48h在倒置显微镜下观察细胞,于48h通过免疫荧光检测MCMV早期抗原EA表达情况,并与TUNEL进行双重免疫荧光染色检测MCMV及自噬抑制剂CQ对细胞凋亡水平的影响;5)MCMV感染MEF后24h和48h提取细胞总蛋白,WB检测自噬标志物蛋白LC3I/II和SQSTM1/p62,以及Phospho-p70 S6 kinase和Cleaved caspase-3表达水平;6)于MCMV感染Eyecup后第7d通过免疫荧光检测MCMV EA表达水平,并分别进行TUNEL与MCMV EA或RPE双重免疫荧光染色检测自噬抑制剂CQ对MCMV诱发细胞凋亡水平及位置的影响;7)采用Image J对MEF和Eyecup组织中EA和TUNEL阳性细胞数量进行自动计数,并用Image J分析各目的蛋白的相对表达水平。【研究结果】1.3-MA和si ATG3抑制自噬可明显抑制HCMV IE2在HELs的表达1)HELs感染HCMV早期或过表达IE2均可激发自噬:在病毒感染后6h,LC3I/II比值即低于对照组（p0.05）;在HCMV感染后48h,3-MA和Rapamycin预处理对HCMV感染诱发的HELs细胞凋亡虽有促进趋势,但作用并不明显（p>0.05）;另外,si ATG3抑制自噬后,对细胞凋亡也有抑制趋势但不明显（p>0.05）。2.自噬抑制剂3-MA可抑制细胞和培养组织中MCMV的病毒复制1)MCMV感染早期诱发自噬而晚期抑制自噬:在MEF细胞,MCMV感染后24h自噬相关蛋白LC3I/II比值降低,即LC3II表达增加（P<0.05）,表明可诱发自噬,但在感染后48h LC3I/II比值升高（P<0.05）,即可明显抑制自噬;在小鼠Eyecup组织培养中,MCMV感染后第4d和第7d时LC3I/II比值明显降低（P<0.05）,提示诱发自噬,而在感染后第10d则LC3I/II比值明显升高（P<0.05）,自噬呈现被抑制状态。2)自噬抑制剂3-MA抑制MCMV在细胞和组织中的增殖:在3-MA处理MEF细胞,在MCMV感染后48h、72h及96h,病毒滴度均明显降低（p0.05）。在MCMV感染Eyecup培养组织中,3-MA抑制自噬后,病毒滴度于感染后4d、7d、10d及14d均明显降低（p<0.05）;而Rapamycin处理诱发自噬时,MCMV感染后4d及7d病毒滴度有所降低（p0.05）;同时,3-MA处理后,Eyecup组织细胞内的病毒早期抗原蛋白EA表达分别于MCMV感染后4d、7d、10d及14d均明显减少（p0.05）,甚至在MCMV感染后7d和14d时EA表达还有所增加（p<0.05）。3.自噬抑制剂3-MA和CQ促进Caspase-3介导的细胞凋亡参与自噬调控病毒复制机制1)MCMV感染晚期促进Caspase-3介导的细胞凋亡:在MCMV感染MEF细胞后48h,Cleaved caspase-3水平较对照组明显增加（P<0.05）;在MCMV感染Eyecup组织后4d、7d、10d及14d,Cleaved caspase-3水平均增加,尤其在感染后7d和10d增加尤其显著（P<0.05）;在MEF感染MCMV后48h,TUNEL与Cleaved caspase-3或p MLKL进行双重免疫荧光染色结果显示,虽然Cleaved caspase-3表达并非完全与凋亡细胞重叠,但有部分TUNEL阳性细胞与Cleaved caspase-3共染;而TUNEL阳性细胞与p MLKL染色没有重叠,但p MLKL主要在TUNEL阳性细胞周围表达。2)3-MA抑制自噬促进MCMV诱导的Caspase-3介导的细胞凋亡:①TUNEL与EA或RPE在MEF或Eyecup中双重免疫荧光染色结果显示,3-MA处理MEF组中MCMV感染诱发的细胞凋亡水平增加即TUNEL阳性细胞数增加,而EA表达减少（p<0.05）;在Eyecup培养组织中,3-MA处理MCMV感染组织后,尤其是7d和14d,TUNEL染色阳性细胞数明显增加（p<0.05）,而在Rapamycin处理的Eyecup病毒感染组,TUNEL染色阳性细胞数无明显改变;②WB结果显示,在MEF中,MCMV感染后48h,3-MA使活化的Caspase-3表达增加（P<0.05）,但在感染后24h,MCMV反而对3-MA引起的Caspase-3活化起一定的抑制作用;而3-MA对细胞程序性坏死通路RIPK1/RIPK3/MLKL在MEF的表达无明显确定和一致影响;在Eyecup培养中,3-MA使MCMV感染后第4d、7d、10d和14d时Cleaved caspase-3和Caspasae-8明显增加（P<0.05）,提示其细胞凋亡通路被激活;但同时3-MA处理在MCMV感染后第4d、7d和10d可明显抑制RIPK1的活化以及抑制磷酸化RIPK3（p RIPK3）和MLKL的表达（P<0.05）,提示细胞程序性坏死通路被抑制。3)另一自噬抑制剂CQ亦可抑制MCMV复制且促进MCMV诱导的Caspase-3介导的细胞凋亡:①与3-MA一样,CQ处理抑制自噬后,无论在MEF感染MCMV后24h和48h,还是Eyecup培养组织感染MCMV后第7d,培养上清中病毒滴度都明显低于对照组（P<0.05）;且在MEF中MCMV感染后48h,CQ对MCMV复制的抑制作用强于3-MA（p0.05）;②TUNEL和MCMV EA双重免疫荧光染色结果显示,在MEF中,CQ干预48h较对照组有更多TUNEL阳性细胞,而EA阳性细胞则有所减少（p<0.05）;在Eyecup组织培养中,CQ干预7d时TUNEL阳性细胞数较模拟处理组有所增加,而EA阳性细胞数减少更明显（p<0.05）;③WB结果显示,CQ可明显促进Caspase-3的活化（p<0.05）,甚至在干预48h时CQ比3-MA的促进作用更强。【结论】1.HCMV即刻早期蛋白IE2是病毒感染早期诱发细胞自噬的重要蛋白;2.在HELs细胞,自噬诱导剂Rapamycin和抑制剂3-MA调控细胞起始自噬状态都可干扰HCMV吸附和进入细胞;3.自噬抑制剂3-MA及沉默ATG3表达抑制细胞自噬均可明显抑制HCMV即刻早期蛋白IE2在HELs内的表达;4.HCMV虽然可诱发THP-1诱导分化的巨噬细胞自噬,但干预自噬水平对病毒蛋白IE2和p UL83表达尚未观察到规律性和一致性影响,这可能与其细胞来源及其复杂的免疫反应相关;5.MCMV感染MEF和Eyecup后,在感染早期可诱发自噬,但在感染晚期抑制自噬;自噬抑制剂3-MA和CQ都可明显抑制MEF和Eyecup细胞内MCMV早期抗原EA表达和活性病毒颗粒的产生与释放,即明显抑制病毒复制;6.MCMV感染晚期可诱发Caspase-3介导的细胞凋亡,自噬抑制剂3-MA和CQ抑制自噬都可通过促进Caspase-3介导的细胞凋亡而非RIPK1/RIPK3/MLKL介导的细胞程序性坏死来间接抑制MCMV在MEF和Eyecup的复制和增殖;而在MCMV感染早期病毒诱导Caspase-3介导的细胞凋亡尚处于较低水平时段,自噬抑制剂主要是通过抑制自噬水平而抑制病毒颗粒的产生及释放。