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研究目的: 本研究通过不同剂量的高能射线照射 6 组胃癌细胞株,筛选出放射耐受的细胞株BGC823和MGC803,明确了DNA依赖蛋白激酶催化亚基 (catalytic sunbunit of the DNA-dependent protein kinase,DNA-PKcs)以及磷酸化蛋白高表达导致了胃癌细胞放射耐受的分子机制,DNA-PKcs抑制剂NU7441可以促进胃癌放射耐受细胞的损伤凋亡,逆转放射抗性;联合CK2抑制剂CX-4945进一步促进胃癌放射耐受细胞凋亡,为提高胃癌放射敏感性提供一种新的策略。 研究方法: (1) 常规培养 SGC7901、HGC-27、MKN45、MKN28 、BGC823、MGC803共 6 株不同胃癌细胞株,在显微镜下观察 6 株细胞株的形态变化,待细胞状态良好并稳定传代后,培养液颜色由澄清变淡黄时,即进入对数生长期,此时细胞的活力最强,适用于实验,将上述细胞按照0Gy、2Gy、4Gy、6Gy的高能射线累计放疗剂量,各细胞通过 VARIAN 直线加速器下行 6MV X 射线照射,剂量率300cGy/min,距离100cm,照射野10cm*10cm,培养板下置等效组织填充物。 (2) 将高能射线照射的6组细胞株置入恒温细胞培养箱中培养至细胞状态良好、稳定传代,通过细胞克隆实验培养12h,24h后,统计细胞数,并计算出细胞生存率,绘制出不同时间胃癌细胞株的生存率条形柱状图,利用 Western blot技术通过观测PARP1、cleaved-capase3、γH2AX、GAPDH的表达量,检测细胞凋亡和DNA损伤指标,通过免疫荧光法进一步检测凋亡损伤情况。 (3) 通过Western blot技术检测不同细胞株中DNA-PKcs以及磷酸化(NU7441影响的磷酸化位点)的蛋白水平和GAPDH,比较两株相对耐受的胃癌细胞与其他细胞的差异,并进一步检测出相对放射耐受细胞株。 (4) 利用CCK8(MTT)检测两株胃癌耐受细胞对DNA-PKcs抑制剂NU7441的IC50(24h)值,通过克隆形成实验绘制出加入小剂量NU7441预处理和空白对照组的时间-细胞存活率曲线,两株胃癌耐受细胞经小剂量NU7441预处理24h后辐照, CCK8(MTT) ,克隆形成检测细胞存活, Western blot 检测 PARP1、cleaved-caspase3、γ-H2AX、GAPDH蛋白表达量,免疫荧光检测损伤指标。 (5) 小剂量NU7441与CK2抑制剂CX-4945联合预处理放射耐受细胞24h后辐照,CCK8(MTT),克隆形成检测细胞存活,Western blot检测细胞损伤修复蛋白指标,免疫荧光检测细胞的损伤指标。 研究结果: (1)细胞平板克隆实验得出0Gy、2Gy、4Gy、6Gy对应剂量下,12h胃癌BGC823的细胞存活率为74%、70%、65%、62%;SGC7901细胞株的存活率为74%、68%、54%、51%;MGC803细胞株的存活率为74%、70%、65%、63%;HGC27细胞株的存活率为53%、57%、50%、43%;MKN45细胞株的存活率为78%、74%、56%、44%;MKN28细胞株的存活率为78%、74%、56%、44%;24h胃癌BGC823的细胞存活率为67%、65%、60%、53%;SGC7901细胞株的存活率为64%、65%、58%、46%;MGC803细胞株的存活率为60%、61%、58%、51%;HGC27细胞株的存活率为58%、56%、52%、50%;MKN45细胞株的存活率为53%、47%、45%、30%;MKN28 细胞株的存活率为 52%、49%、35%、25%。并进一步绘制出不同胃癌细胞株生存率条形图,Western blot方法检测在4Gy 6MV X射线后的PARP1蛋白的表达量得出BGC823、MGC803明显高于其他4组细胞株,cleaved-caspase3蛋白、γ-H2AX蛋白表达量BGC823、MGC803细胞明显低于其他4组细胞株,差异有统计学意义(P<0.05),表现出相对放疗耐受,免疫荧光法检测出γ-H2AX、DAPI的荧光度明显弱于其他4组细胞株,差异有统计学意义(P<0.05)。 (2) 通过Western blot方法检测6组在4Gy 6MV X射线后的DNA-PKcs以及磷酸化( NU7441 影响的磷酸化位点)的蛋白水平和 GAPDH , p-DNA-PKcs 和DNA-PKcs的灰度值明显高于其他4组细胞株,差异有统计学意义(P<0.05)。 (3)通过CCK实验得出不同浓度的NU7441的放疗后BGC823、MGC803细胞存活率并绘制出生存率曲线得出,BGC823的IC50值为3.724umol/L,MGC803的IC50值为4.704umol/L,随着NU7441浓度增加,细胞的生存率显著下降,将剂量的NU7441和空白对照组放射耐受细胞株BGC823、MGC803,0h、12h、24h、48h的细胞生存率曲线可以得出,空白对照组细胞存活率明显高于加入小剂量NU7441组,通过 Western blot 方法检测 BGC823、MGC803 细胞株空白对照组和加入NU7441的γ-H2AX的灰度值,发现加入NU7441的细胞株γ-H2AX的灰度值明显升高,免疫荧光法显示加入NU7441的γ-H2AX荧光亮度增加,差异有统计学意义(P<0.05)。 (4) 使用DNA-PKcs抑制剂NU7441和CK2抑制剂CX-4945联合,相比单纯使用NU7441对照组显示时间-生存率曲线提示联合用药可以进一步促进损伤凋亡,通过 Western blot 得出,联合用药 γ-H2AX 的灰度值增加,免疫荧光法显示加入NU7441的γ-H2AX荧光亮度增加,差异有统计学意义(P<0.05)。 研究结论: (1)本研究通过对6组不同的细胞株经过射线照射筛选出BGC823、MGC803胃癌细胞株相对放射耐受。 (2)DNA-PKcs以及磷酸化蛋白高表达与胃癌细胞的放射耐受密切相关,可能和细胞修复机制有关。 (3)明确了DNA-PKcs抑制剂NU7441可以促进胃癌放射耐受细胞的损伤凋亡。 (4)NU7441和CX-4945联合可以进一步促进胃癌放疗耐受的细胞凋亡,提升放疗疗效。