研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是以记忆力减退、认知功能障碍为特征的中枢神经系统变性疾病,是老年人中常见的一种痴呆症。AD的病理学特征主要包括脑中神经细胞外8-淀粉样多肽(β-amyloid peptide, Aβ)的沉积导致的老年斑,细胞内过度磷酸化Tau蛋白导致的神经纤维缠结和神经细胞元细胞的缺失营养坏死。近年来的研究表明,采用Aβ抗原的主动免疫刺激机体产生免疫Aβ抗体,不仅抑制了脑中Aβ纤维斑块的形成,还可明显地改善实验鼠的行为和认知障碍。免疫接种疫苗清除Aβ,有可能从根本上阻止和逆转AD的病理过程,为预防和治疗AD的研究提供新的思路。但是AD主动免疫的临床Ⅱ期研究中发现有6%的研究对象出现了脑炎反应的毒副作用,目前导致这种脑炎的具体原因尚不清楚,但相关的研究提示脑炎的发生可能是T淋巴细胞介导的细胞免疫反应的结果,Q521佐剂的作用可能参与了脑炎副作用的发生过程。因此,寻找安全而且可靠的佐剂成为AD主动免疫治疗研究的一个重要方面。霍乱毒素B亚单位(cholera toxin B subunit, CB)是霍乱弧菌产生的外毒素B亚单位,能与所有有核细胞膜上的神经节苷脂(ganglioside, GM1)受体结合,具有加强抗原表位抗原性的特点[15]。CB可以作为粘膜免疫佐剂,用于强化多糖、小肽等半抗原,可以增强B淋巴细胞的反应(Th2反应),刺激机体产生高滴度的抗体,而且不刺激产生T淋巴细胞免疫反应(Th1反应)。CB在AD免疫研究中可以作为一种安全的佐剂使用于Ap疫苗免疫。除CB外,铝佐剂(AL)同样能够抑制Th1反应,是一种临床上常用的安全佐剂。因此,AL同样可以被选用于AD疫苗。选用CB、AL佐剂有可能可以降低AD免疫研究中出现的脑炎副作用。鼻粘膜在抗原的刺激下能够诱导机体产生体液免疫为主的反应,而且采用鼻粘膜免疫的方式,操作简便,便于多次加强免疫。本实验在充分考虑了佐剂安全性的基础上,选择具有良好安全性的CB、AL佐剂,配合Aβ多肽抗原,经鼻粘膜分别免疫转基因痴呆模型鼠(J20),探讨它们对Aβ多肽抗原效应的增强作用,增强的抗体效应是否能在小鼠体内发挥有效的生物学效应,包括：减少小鼠脑中Aβ的含量,抑制脑中Aβ纤维斑块的形成,改善小鼠的学习记忆能力；检测免疫后小鼠脑中Th1, Th2反应及乙酰胆碱酯酶(AChE)的含量；同时进行CB、AL二者之间的比较。实验方法繁殖转基因痴呆模型鼠,子代鼠用PCR法基因鉴定。选取转基因阳性痴呆模型鼠24只,至7月龄时随机分成4组：Aβ+CB组,Aβ+AL组,单Aβ组,阳性对照组,另设1组转基因阴性对照组,每组6只。鼻腔滴入免疫小鼠,1次／周,持续5个月,采用间接ELISA法检测小鼠的血清抗体效价。免疫结束后,Morris水迷宫实验检测小鼠的学习记忆能力。水迷宫实验完成后,脱颈法处死小鼠,取小鼠左半侧脑组织制备脑匀浆上清液,双抗夹心ELISA法检测脑中Aβ的含量；取小鼠右半侧脑组织固定,免疫组织化学染色观察脑中Aβ斑块的形态。另外,ELISA试剂盒检测上述的脑匀浆上清液中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10细胞因子浓度及AchE含量。实验结果免疫5个月后,Aβ+CB组抗体效价最高(1：4000),其次为Aβ+AL组(1：2000),而未加佐剂的单Aβ组最低(1：500)。Morris水迷宫实验,与阳性对照组比较,Aβ+CB组寻找隐性平台时间缩短了50%左右(P<0.05),Aβ+AL组寻找隐性平台时间虽缩短了20%-40%,但标准差大,统计学差异无显著性(P>0.05),而单Aβ组寻找隐性平台时间没有明显缩短(P>0.05)。脑中Aβ的相对含量检测结果,与阳性对照组脑中A β的相对含量(1.012±0.323)相比,Aβ+CB组脑中A β的相对含量(0.383±0.156)明显减少(P<0.05),Aβ+AL组A β的相对含量(0.728±0.249)略有降低,而单Aβ组Aβ相对含量(1.016±0.301),数值上与阳性对照组很接近。免疫组织化学观察,阳性对照组,海马区,齿状回周围以弥散的非神经突斑为主,与其他组海马区比较,AD斑块量最多；大脑皮质区,脑中Aβ斑块以弥散性的神经突斑,弥散性的非神经突斑为主,与其他组的大脑皮质区比较,Aβ斑块量最多。与阳性对照组比较,Aβ+CB组,海马区,齿状回周围同样以弥散的非神经突斑为主,Aβ斑块量减少了56.4%(P<0.05)；大脑皮质区以弥散的非神经突斑为主,斑块较小,Aβ斑块量减少了45.6%(P<0.05)。Aβ+AL组海马区所见的Aβ斑块形态与阳性对照组类似,Aβ斑块量虽减少了30%左右,但统计学分析差异无显著性(P>0.05)；大脑皮质区所见的Aβ斑块形态与阳性对照组类似,Aβ斑块量未见明显减少(P>0.05)。免疫5个月后,实验各组脑中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10细胞因子浓度,脑中乙酰胆碱酯酶(AchE)含量,统计学分析差异无显著性(P>0.05)。结论使用CB佐剂增强了Ap的抗原效应,减少了痴呆鼠脑中Aβ的含量、抑制了脑中Aβ斑块的形成,改善了小鼠的学习记忆能力,而且使用CB佐剂的作用效果比AL更明显。本研究结果为AD主动免疫的佐剂研究提供了一种新的选择,具有潜在的应用前景。