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第一部分高通量单核苷酸芯片筛选肝癌相关基因AMY1目的:探讨利用全基因组关联分析(Genome-wide association study, GWAS),在人类全基因组范围内找出存在的序列变异,即单核苷酸多态性位点,结合显著性优势以及成簇性优势寻找与肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)发生发展可能相关的易感基因。方法:1.用Affymetrix500K SNP (Single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性)芯片检测50例病例组(乙肝表面抗原阳性的肝癌患者)和年龄、性别相匹配的50例对照组(乙肝表面抗原阳性的健康携带者)中的全基因组的SNP位点;2.对所有染色体上的位点,用卡方检验和Fisher精确概率检验等位基因频率、基因型频率和Cochran-Armitage Trend检验,得到3个P值,最小的P值称为minP;3.根据P<0.001为标准,选出最具显著性的位点,结合成簇性优劣,选择与HCC发生发展可能相关的易感基因。结果:1.minP小于0.05的SNP s位点共有21154个,其中小于1×10-3的SNPs位点有357个,达到10-5水平的有26个,一个位点minP值达到10-8水平。2.利用PubMed公用数据库对P值小于1×10-3的357个SNPs所在连锁区(Haplotype block)段进行查阅,发现有近三分之一的基因已经报道与肿瘤相关。3.以P<0.001为标准选出357个在整套数据中最具显著性的位点,统计各SNP位点所在等位基因频率在对照组与病例组间分布差异,以P<0.001为标准选出325个最具显著性的SNP位点,分别位于1、2、5、6、7、8、14、15、17、19号染色体。4.进一步结合成簇性优劣,我们选择位于1号染色体短臂21区段的唾液淀粉酶基因(Alpha-Amylase1, AMY1)作为候选基因进一步研究,其中编号为rs1334125的SNP位点minP值为2.19×10-5,临近区域共有7个位点P值小于0.05。目前尚无关于AMY1基因与HCC相关性的研究报道。结论:利用全基因组关连分析在人类全基因组水平检测SNP位点,并结合显著性和成簇性优劣是一种研究肝细胞肝癌发生发展易感基因的有效方法,它可以帮助寻找既往未曾发现的新的与肿瘤密切相关的易感基因。第二部分AMY1与肝细胞肝癌临床病理特征及预后的关系目的:探讨唾液淀粉酶基因(Alpha-Amylase1, AMY1)与肝细胞肝癌临床病理特征以及预后的相关性。方法:1.制作91例HCC患者肝癌组织和癌旁组织的组织芯片,应用免疫组化检测癌组织和癌旁组织中AMY1表达差异;2.免疫组化检测2006-2009年在中山医院手术并随访至2011年12月的96例HCC患者癌组织和癌旁组织中AMY1的表达,利用显微镜成像系统以及计算机Image Plus and Pro(IPP)软件定量分析AMY1的表达量(累计光密度值,Intergrated Option Density, IOD)与各临床病理特征的关系;取AMY1表达量IOD值中位数,将队列分成AMY1高表达组(48例)以及低表达组(48例),Kaplan-Meier曲线分析两组间预后差异;3.在8株不同的肝癌细胞株和1株正常肝细胞株中应用Western Blot蛋白印迹法检测AMY1的表达。结果:1.91例组织芯片中,男性79名,女性12名,中位年龄55岁,癌组织中AMY1表达阳性率76.92%(70/91),明显低于癌旁组织阳性率94.50%(86/91),P<0.05;2.96例组织切片中,男性85例,女性11例,中位年龄51.5岁,癌组织中AMY1表达量IOD值为1.88±2.21×105,明显低于癌旁组织IOD值4.03±3.35×105,P<0.001;3.随肿瘤最大直径增大,癌组织中AMY1表达量下降,P<0.05;无癌栓组中癌组织AMY1表达量明显高于有癌栓组,P<0.05;癌组织中AMY1表达量与其他临床病理特征(年龄、性别、肝硬化病史、有无肿瘤包膜以及肿瘤TNM分期)均无明显相关。癌旁组织中AMY1表达量与各临床病理特征无明显相关;4.癌组织中AMY1高表达组中位生存期34.5月,高于低表达组25.8月,P<0.05;癌组织中AMY1高表达组中位无瘤生存期25.0月,高于低表达组11.9月,P=0.052。癌旁组织中AMY1表达量与生存预后无明显相关性;5.Western Blot蛋白印迹法显示,AMY1仅在分化较好的HepG2肝癌细胞株和无转移潜能的Hep3B细胞株中表达,其余各肝癌细胞株以及正常肝细胞细胞株中均无表达。结论:唾液淀粉酶基因AMY1可能与HCC发生过程相关,并且可能通过抑制肿瘤生长、侵袭迁移从而对机体起到保护作用,使患者获得更好的生存预后。