三角帆蚌(Hypriosis cumingii)是我国特有的淡水育珠蚌,近几年来淡水珍珠产量的95%都是来自于三角帆蚌。在三角帆蚌的贝壳和珍珠的研究中,鉴定和分析基质蛋白的组成和功能对理解其珍珠质的形成机理具有非常重要的意义。以前所研究的贝壳基质蛋白大都是从海水贝类中分离鉴定的,有关淡水贝类贝壳基质蛋白的研究还比较少。本研究从三角帆蚌外套膜中分离鉴定得到了一个新的贝壳基质蛋白基因silkmapin,并对其结构和功能进行了研究。1.对三角帆蚌silkmapin基因进行了克隆、序列分析、结构预测、组织表达分析及原位杂交检测。运用RACE技术得到该基因c DNA序列的全长为1242bp,拥有一个978bp的开放阅读框。该基因编码一个30.89KD的蛋白质,主要含有甘氨酸(Gly),占整个分量的34.41%,序列中所含的天冬氨酸(Asp)主要集中在C末端,推测silkmapin的C末端具有结合Ca2+的能力。二级结构推测结果表明silkmapin主要为β折叠,高级结构为一细丝状蛋白质。实时定量PCR结果表明silkmapin只在外套膜的边缘外褶和缘膜部的上皮细胞表达。进一步进行原位杂交检测,结果与实时定量PCR的结果一致,在外套膜边缘和缘膜部的上皮细胞中检测到了强烈的信号,实时定量PCR和原位杂交的结果可以说明silkmapin参与了三角帆蚌贝壳珍珠层和棱柱层的形成。2.通过贝壳修复实验研究silkmapin在贝壳生物矿化中的作用。将三角帆蚌进行活体破壳处理,破壳的一边作为实验组,同时设有两个对照组,对外套膜组织和修复壳样品进行收集,修复出的新壳用以进行扫描电子显微镜(SEM)观察,外套膜组织样品用以荧光定量表达分析。扫描电镜观察结果显示三角帆蚌贝壳生长过程是由外而内逐层生长,生长顺序依次为角质层—棱柱层—珍珠层。薄薄的角质层最先完成生长,之后棱柱层文石晶体颗粒在角质层表面生长,棱柱层晶体生长是在横向和纵向两个方向上同时进行。棱柱层达到成熟后,片状的正六边形文石珍珠层晶体在其上开始堆积,从棱柱层生长转向珍珠层时候无明显的过渡期。还发现棱柱层生长符合“挤压假说”的特点,而珍珠层则是典型的“砖墙型”结构。结合扫描电镜观察和在不同时期外套膜中表达的结果,发现在棱柱层和珍珠层生长的时期,silkmapin在破壳实验组中的表达量远远高于对照组,说明silkmapin的确参与了三角帆蚌贝壳棱柱层和珍珠层的矿化过程。3.通过插片实验进一步研究silkmapin在三角帆蚌珍珠形成过程中的作用。选取了健康规格相同的三角帆蚌进行无核珍珠插核手术,定期进行珍珠囊组织样品采集和珍珠小颗粒的收集,珍珠囊组织样品用以进行荧光定量组织表达分析;珍珠小颗粒经过处理后放在扫描电子显微镜(SEM)下进行表面形貌的观察。扫描电镜观察的结果表明三角帆蚌珍珠的矿化生长过程分为碳酸钙无序沉积和有序沉积两个阶段。这两个阶段珍珠颗粒的表面形貌变化也很明显,从一开始的凹凸不平、杂乱堆积到后来的平整光滑、有序堆叠。结合电镜观察和在不同时期珍珠囊中表达的结果,发现silkmapin在珍珠成核期的表达量呈现一个逐步上升的趋势,碳酸钙有序沉积阶段的表达量高于无序沉积阶段,在珍珠层最初形成期表达量最高。这说明silkmapin在三角帆蚌珍珠矿化的过程起关键的调控作用,既参与了珍珠质形成必不可少的碳酸钙成核过程,也调控了珍珠层文石小片的生长堆叠。