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目的肝细胞癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,化学治疗在中晚期HCC治疗中发挥着重要作用。近年来,有研究表明癌症的发生发展与许多相关基因的表达和结构异构化相关,并且是一个多步骤、多基因参与的复杂过程。因此,基因治疗有望成为一种具有良好前景的癌症治疗策略。本研究合成了分子中富含醛基的氧化普鲁兰多糖(ox PL)和分子中含二硫键的聚(β-氨基)酯(ssPBAE),并以其为材料构建了一种具有pH与氧化还原双重响应性的共载模型基因(包括pDNA及FAM-DNA)与化疗药物阿霉素(DOX)的纳米体系,以期实现对基因和药物的肝癌靶向递送及其对肝癌的协同治疗作用。内容本论文的研究内容主要分为三部分。第一部分为高分子前药ssPBAE-ox PLDOX的制备与表征,包括ssPBAE、ox PL以及ssPBAE-oxPL-DOX的合成与化学结构的表征。第二部分为双重响应性纳米体系ssPBAE-ox PL-DOX/pDNA的制备及体外性质研究,主要包括双响应性纳米体系ssPBAE-ox PL-DOX/pDNA的制备、表征与形貌观察,以及高分子前药ssPBAE-ox PL-DOX体外靶向性、双响应性纳米体系ssPBAE-ox PL-DOX/pDNA中基因和药物的氧化还原和pH双响应性释放、细胞毒性、细胞凋亡及细胞周期考察等;同时以荧光标记的FAM-DNA为模型基因考察肝癌细胞对该基因/药物纳米共载体系的摄取情况。第三部分为双响应纳米体系ssPBAE-oxPL-DOX/pDNA的体内研究,包括HCC荷瘤小鼠模型的构建及体内组织分布的考察。方法1.高分子前药ssPBAE-oxPL-DOX的制备与表征:以普鲁兰多糖为原料,通过高碘酸钠氧化合成oxPL,并利用红外光谱(IR)对其化学结构进行表征,采用羟胺盐酸盐/电位滴定法和凝胶渗透色谱法对ox PL中醛基含量和相对分子量进行测定;以二硫代二乙醇和丙烯酰氯为原料合成中间产物二硫代二乙醇酯(DESA),而后DSEA与5-氨基-1-戊醇通过迈克尔加成反应合成ssPBAE,利用核磁共振氢谱(1H NMR)对DSEA和ssPBAE的化学结构进行表征;将ssPBAE经二乙烯三胺改性得到氨基化的ssPBAE(NH-ssPBAE),得到的NH-ssPBAE与oxPL通过Schiff’s反应制备ssPBAE-oxPL,利用IR和1H NMR对NH-ssPBAE和ssPBAE-oxPL化学结构进行表征;将ssPBAE-ox PL与DOX通过腙键连接得到高分子前药ssPBAE-ox PL-DOX,采用紫外分光光度法测定高分子前药ssPBAE-oxPL-DOX的载药量,同时利用氰基硼氢化钠还原ssPBAE-oxPL-DOX结构中的腙键合成不具pH-响应性的R-ssPBAE-oxPL-DOX;通过IR对ssPBAE-oxPL-DOX和R-ssPBAE-ox PL-DOX进行化学结构表征,分析比较ssPBAE-oxPL-DOX腙键的成功合成,并考察其酸敏感性。2.双重响应性纳米体系ssPBAE-ox PL-DOX/pDNA的体外研究:将ssPBAE和ssPBAE-oxPL-DOX通过静电作用包载pDNA形成ssPBAE/pDNA和ssPBAE-oxPL-DOX/pDNA纳米粒;通过琼脂糖凝胶电泳法检测ssPBAE和ssPBAE-oxPL-DOX对pDNA的包载能力;采用透射电镜(TEM)观察ssPBAE/pDNA和ssPBAE-oxPL-DOX/pDNA的结构形貌,采用动态激光散射法检测ssPBAE/pDNA和ssPBAE-oxPL-DOX/pDNA纳米粒的粒径及其分布,并采用Zeta电位分析仪考察ssPBAE/pDNA和ssPBAE-oxPL-DOX/pDNA表面荷电性质;通过琼脂糖凝胶电泳法检测ssPBAE/pDNA和ssPBAE-ox PL-DOX/pDNA纳米粒中pDNA的氧化还原响应性释放;考察ssPBAE-ox PL-DOX/pDNA纳米体系在含10%胎牛血清(FBS)生理盐水中的稳定性;采用动态透析法考察在pH 7.4,6.5和5.5释放介质液中ssPBAE-oxPL-DOX/pDNA纳米粒的释药特征,评价其pH响应性释药性能。利用CCK-8法检测ssPBAE-oxPL-DOX/pDNA纳米体系对肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用;激光共聚焦显微镜观察ssPBAE-ox PL-DOX在肝癌HepG2细胞和肺癌A549细胞中的摄取情况,体外评价其肝癌靶向性。通过细胞流式术分析DOX、ssPBAE-oxPL/pDNA和ssPBAE-ox PL-DOX/pDNA纳米粒对HepG2细胞凋亡的诱导作用及其细胞周期的影响。此外,以荧光标记的FAM-DNA为模型基因,制备ssPBAE-ox PL-DOX/FAM-DNA纳米粒,利用激光共聚焦显微镜考察其在HepG2细胞中的入胞情况。3.双重响应性ssPBAE-oxPL-DOX/pDNA纳米体系的体内肝癌靶向性考察:通过皮下注射HepG2细胞构建裸鼠肝癌模型;对ssPBAE-ox PL-DOX/FAM-DNA纳米粒进行Cy5.5荧光标记,利用小动物活体成像技术检测纳米粒通过尾静脉注射给药后在荷瘤小鼠体内的组织分布情况,评价该纳米共载体系的肝癌靶向性。结果1.通过控制NaIO4的投入量,成功合成了不同氧化度的oxPLs,并通过IR光谱对其化学结构进行了确证,同时测定了oxPLs的分子量及其分子中醛基的含量。成功合成了DSEA和ssPBAE,利用1H NMR波谱对它们的化学结构进行了确证。成功制备了两种高分子前药ssPBAE-ox PL-DOX(pH-敏感型)和R-ssPBAE-oxPL-DOX(pH-不敏感型),载药量为3.6%,并利用IR光谱与1H NMR波谱对其化学结构进行了确证。2.成功制备了ssPBAE/pDNA和ssPBAE-ox PL-DOX/pDNA纳米粒,通过透射电镜观察ssPBAE/pDNA呈规则球状形态,粒径小于200 nm,分布均匀;而ssPBAE-oxPL-DOX/pDNA纳米复合物呈非球状形态,粒径小于200 nm。凝胶电泳结果表明,ssPBAE和ssPBAE-ox PL-DOX对pDNA与FAM-DNA具有良好的携载能力,并且ssPBAE-oxPL-DOX/pDNA纳米粒中pDNA的释放呈现一定的氧化还原响应性,还原剂β-巯基乙醇能够触发pDNA的加速释放。ssPBAE-oxPL-DOX/pDNA纳米粒在含10%FBS溶液中的稳定性良好;DOX的体外释放呈现pH-响应性,随着释放介质pH值的降低,释药速率明显增加。ssPBAE-oxPL-DOX/pDNA纳米粒能够显著抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,并阻滞细胞周期于S期。激光共聚焦观察和流式细胞监测数据表明纳米共载体系能够有效携载FAM-DNA和DOX进入细胞。3.经尾静脉注射给药24h后,ssPBAE-ox PL-DOX/FAM-DNA纳米粒子主要蓄积于HepG2荷瘤小鼠的肿瘤组织中,肝脏中也有少量分布。结论成功制备了基于oxPL和ssPBAE的高分子前药ssPBAE-oxPL-DOX,其能有效地负载基因,并实现基因和药物的氧化还原和pH-双响应性体外释放。在细胞水平,ssPBAE-oxPL-DOX具有明显的肝癌靶向性,能够携载基因及药物入胞,并且能够有效地抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。在HepG2荷瘤裸小鼠体内,该纳米共载体系表现出良好的肝癌靶向性。综上所述,这种新颖的双响应性纳米体系在联合基因治疗与化疗治疗肝癌的应用中具有巨大潜力。