肾癌是泌尿系统威胁人类健康的常见恶性肿瘤,对放疗、化疗均不敏感。由于肾癌起病隐匿,在诊断时有25～30%已发生转移。而且,即使是局限性肾癌,采取根治术后仍有近30%患者会复发。针对这部分转移及复发肾癌的治疗是泌尿外科的难点和研究方向。随着研究深入,发现肾癌特别是透明细胞癌多存在Von Hippel-Lindau(VHL)基因突变,乏氧诱导因子(hypoxia-inducible factor, HIF)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达增高,而且VEGF增高与肿瘤分期及预后密切相关。因此,抑制或阻断VHL-HIF-VEGF信号通路,特别是阻断VEGF或其受体VEGFR,就可能抑制肾癌的生长。贝伐单抗(Bevacizumab)是VEGF特异性的经过人源化改造的鼠源抗体,能特异性与VEGF结合并阻断其生物活性。贝伐单抗联合IFN-α可以提高转移性肾癌的客观缓解率(ORR)和无疾病进展率(PFS)。2007年12月美国FDA批准贝伐单抗联合IFN-α作为靶向治疗转移性肾癌的一线治疗方案。然而,通过杂交瘤技术获得的单抗需经过人源化改造,一方面不可能完全去除抗体的免疫原性,另一方面抗体空间构型可能发生改变,亲和力往往会降低,很难达到预期的作用效果。为了尽可能减少药用抗体的免疫原性,研究者尝试利用哺乳动物细胞表面抗体展示技术用于人源抗体的筛选,但目前的这些哺乳动物细胞表面展示技术所构建抗体库容量多局限于104～106,筛选抗体多样性不足,不能满足筛选高亲和力抗体的要求。为了克服哺乳动物细胞表面展示技术筛选全长人源抗体存在的上述不足,本课题组对现有的哺乳动物细胞展示技术作了技术改良。人的VEGF是一种自身蛋白,以来自于自身免疫病患者的外周血淋巴细胞为材料构建抗体库筛选到抗VEGF抗体的几率更大。通过提取自身免疫病患者的外周血淋巴细胞的总RNA,进行RT-PCR扩增全套抗体基因,随后使用哺乳动物细胞表达载体pDGB-HC-TM,构建了三个全长人源抗体基因库,库容量达到1010以上。将抗体基因库通过四片段连接插入哺乳动物细胞表达载体pDGB4,然后将其稳定转染FCHO细胞。由于采用基因定点整合技术,每个细胞只表达一种抗体,从而成功建成能展示全长抗体的哺乳动物细胞库。本课题通过全基因合成的方法合成了贝伐单抗的全长基因,并根据哺乳动物细胞对密码子的选择性对抗体基因的碱基序列进行表达优化,既作为筛选抗体的阳性对照,同时也用于抗体的链置换筛选技术,以提高筛选VEGF特异性抗体的成功率；与已经构建好的三个抗体库基因进行链置换,构建了全长人源抗VEGF抗体库,并成功将其展示于哺乳动物细胞表面。一、全长人源初级抗体库的构建及展示目的：构建大容量的全长人源初级抗体基因库。方法：1.外周血淋巴细胞的分离及总RNA的提取从供体中采集适量静脉血,置于肝素抗凝管中,采用密度梯度离心法分离外周血单核细胞,加入适量Buffer RLT,裂解细胞,—80℃冰箱保存备用或者直接用于提取总RNA。2. cDNA第一链的合成以总RNA为模板,应用根据V-BASE网站信息所设计合成的全套人抗体重链可变区引物和全套人抗体轻链恒定区引物,逆转录合成cDNA第一条链。3.全套IgG1重链可变区基因和轻链K型全长基因的扩增以合成的cDNA为模板,用相应的特异性引物扩增全套IgG1轻链K型全长基因及全套IgG1重链可变区基因(3套轻链引物,3套重链引物)。PCR条件为：94-C预变性5分钟,然后进行35个循环的PCR扩增(94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min),随后在延长温度下反应7min,以确保全长目的片段的合成。PCR扩增产物的分离纯化用PCR扩增抗体全套Kappa轻链和重链可变区基因。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段。然后将回收得到的3组重链基因PCR扩增产物,再次经1%琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段备用。并用同样方法处理3组轻链PCR扩增产物。重链抗体基因库及轻链基因库的构建及鉴定以BsmBI对重链基因扩增产物及载体pDGB-HC-TM进行酶切,电泳分离纯化目的片段,将回收的载体片段和抗体基因片段用T4DNA连接酶按1：1比例混合连接,在16℃反应24h后导入化学转化感受态大肠杆菌TOPO-10,构建重链基因库。轻链全长基因的扩增产物经SfiI酶切后回收,与同样经SfiI酶切回收的载体pDGB-HC-TM片段用T4DNA连接酶按1：1比例混合连接,在16℃反应24h后导入化学转化感受态大肠杆菌TOPO-10,构建轻链基因库。分别从重链抗体库和轻链抗体库中各随机挑取10个单克隆,摇菌培养过夜后抽提质粒,测序分析抗体基因库的质量及多样性。4.抗体库在哺乳动物细胞表面的展示分别将中提所获得的重链库pDGB-HClib-TM与轻链库pDGB-LClib的质粒DNA共转染293T细胞,将上述转染后继续培养48-72h的293T细胞进行回收,然后行免疫荧光染色及流式细胞学分析。结果与讨论：分离获得淋巴细胞的数量总计为1.4×108个。取一定量的细胞裂解物,提取获得约3.5u g总RNA,其A260/A280的值为1.90。PCR扩增共获得约2μg的全套IgG1轻链K型全长基因和约2μg的全套重链可变区基因。根据在带有氨苄青霉素抗性的LB平皿上长出的细菌克隆数,计算所构建的抗体重链基因库库容量为1.89×105,背景克隆的比例为3.60%；抗体轻链基因库库容量为6.54×104,背景克隆的比例为1.65%。用同样的方法一共构建了三个大容量的全长人源抗体基因库,库容量分别为1.19×1010、2.0×1010和5.27×1011。在其中一个抗体基因库里面的重链库和轻链库中各挑取10个单克隆进行测序分析,结果表明重链库的10个单克隆中有8个含有正确的VH编码序列,编码8个特异的氨基酸序列；轻链库的10个单克隆中有7个含有正确的LCκ编码序列,编码7个特异的氨基酸序列。将此重链库和轻链库共转染哺乳动物细胞后,理论上抗体库的多样性可以达到6.67×109[(1.89×105×80%)×(6.54x104x70%)],可以满足筛选高亲和力、高特异性抗体的要求。将抗体库瞬时转染293T细胞后,在63.40%的细胞表面可以检测到全长人源抗体的表达。结论：本研究采用哺乳动物细胞展示技术,成功用哺乳动物细胞表面展示载体pDGB-HC-TM构建了库容量大且多样性好的全长人源抗体基因库,可以满足筛选高亲和力、高特异性抗体的要求。二、全长人源二级抗体库的构建及展示目的：将第一部分构建好的三个初级抗体基因库通过四片段连接插入哺乳动物细胞表达载体pDGB4,构建三个全长人源二级抗体库,并将此三个抗体基因库合并一起稳定转染哺乳动物细胞FCHO,获得能够稳定展示全长人源抗体的哺乳动物细胞库。方法：1.双表达载体pDGB4的制备以BsmBI和SfiI对载体pDGB4进行双酶切,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,并分离纯化5kb和3kb的两段目的DNA片段。2.抗体基因的制备以第一部分已经制备的抗体重链基因库(pDGB-HClib-TM)的细菌沉淀为来源,进行质粒中提获得抗体重链基因库的质粒DNA；用BsmBI进行酶切,用1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化0.45kb的DNA片段。以第一部分已经制备的抗体轻链基因库(pDGB-LClib)的细菌沉淀为来源,进行质粒中提获得抗体轻链基因库的质粒DNA；用SfiI进行酶切,用1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化0.75kb的DNA片段。3.转化感受态大肠杆菌TOPO-10及单克隆转染将获得的抗体轻重链基因库片段插入到pDGB4载体的相应酶切位点之间,获得pDGB-Full-Length-lib。转化化学感受态大肠杆菌TOPO-10,构建全长人源二级抗体库。用同样的方法将第一部分所构建的另外2个初级抗体基因库构建成为四片段连接的全长人源二级抗体库。在转化菌落中随机挑取十个单克隆,进行质粒DNA的小提。4.抗体库在哺乳动物细胞表面的展示将二级抗体库的质粒DNA瞬时转染293T细胞,用PE标鼠抗人kappa链抗体进行细胞免疫荧光染色,用流式细胞仪进行检测分析。5.构建稳定表达单克隆抗体的细胞库将上述构建的三个四片段连接二级抗体库质粒中提后进行1：1：1合并,与pOG44的质粒DNA共转染常规培养至对数生长期的FCHO细胞,构建稳定表达抗体的细胞库。结果与讨论：根据在带有氨苄青霉素抗性LB平皿上长出的克隆数,计算所构建的全长抗体二级基因库库容量为2.476x106,背景克隆的比例为0.30%。用同样的方法将第一部分构建好的第二、第三个初级抗体库基因通过四片段连接插入哺乳动物细胞表达载体pDGB4,构建了第二、第三个四片段连接二级抗体库,库容量分别为9.22×105和1.0828×106,背景克隆的比例分别为0.06%和0.17%。从二级抗体库的建库菌平皿中随机挑取十个单克隆进行质粒小提后瞬时转染293T细胞,流式细胞仪检测有9个克隆能够表达出抗体。将中提获得二级抗体库的质粒DNA进行293T细胞的瞬时转染,有61.78%的细胞表面可成功展示可被检测到的全长抗体。将三个四片段连接二级抗体库基因进行质粒中提后稳定转染FCHO细胞,成功构建了稳定细胞库,库容量为3.76×106,用流式细胞仪检测有59.62%的细胞表面可成功展示可被检测的全长抗体。结论：成功将第一部分构建好的三个初级抗体库基因通过四片段连接插入哺乳动物细胞双表达载体pDGB4,构建了三个全长人源二级抗体库,并将此三个基因库合并一起稳定转染哺乳动物细胞FCHO,获得能够稳定展示全长人源抗体的哺乳动物细胞库,为特异性抗体的筛选奠定了基础。三、全长人源抗VEGF抗体库的构建及展示目的：合成并优化贝伐单抗的全长基因,与前面构建好的三个抗体库进行链置换,构建全长人源抗VEGF抗体库。方法：1.贝伐单抗序列的合成与优化在贝伐单抗的重链可变区碱基序列前面加上BstXI和BsmBI的酶切序列以及信号肽序列,将其序列进行人类密码子偏向性优化以及基因表达的优化,以BsmBI进行酶切,1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化0.45kb大小的目的DNA片段。在贝伐单抗的轻链可变区碱基序列前面加上SfiI的酶切序列以及信号肽序列,将其序列进行人类密码子偏向性优化以及基因表达的优化,采用重叠延伸PCR技术进行轻链全长的制备,再以SfiI进行酶切,用1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化0.714kb大小的目的片段。2.双表达载体pDGB4片段的制备以BsmBI和SfiI对载体pDGB4进行双酶切,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,并分离纯化5kb大小和3kb大小的两段目的DNA片段。3.构建质粒pDGB4-avastin将载体pDGB4片段和优化后合成、制备的贝伐单抗重链抗体片段、轻链抗体片段分别酶切并纯化后,抗体重链基因和抗体轻链基因同时插入到pDGB4载体的相应酶切位点之间,转化化学感受态大肠杆菌TOPO-10,随机挑取单克隆,使用两套引物分别对单克隆的贝伐单抗链可变区序列和轻链可变区序列进行PCR鉴定,根据PCR鉴定的结果,将单克隆菌液进行扩增培养、小提测序分析。4.链置换法构建抗VEGF抗体库以BsmBI对载体pDGB4进行单酶切,分离纯化8.65kb大小的目的片段。将该载体片段与经由BsmBI进行酶切并纯化后的贝伐单抗重链抗体片段进行连接获得新质粒pDGB4-avastin-vh,转化化学感受态大肠杆菌TOPO-10,用引物247和引物248来进行PCR鉴定后进行质粒中提,以SfiI进行酶切,分离纯化约8.3kb大小的目的片段,与同样经由SifI进行酶切全长人源轻链基因库(pDGB-LClib)手纯化出的轻链抗体库基因片段进行连接,获得新质粒pDGB4-avastin-vh-Hu-LCs,转化化学感受态大肠杆菌TOPO-10,构建含贝伐单抗重链的全长人源抗VEGF抗体库,计算抗体库的库容量。同样用链置换方法,获得新质粒pDGB4-avastin-vk-Hu-HCs,转化化学感受态大肠杆菌TOPO-10,构建含贝伐单抗轻链的全长人源抗VEGF抗体库,计算抗体库的库容量。结果与讨论：分别在贝伐单抗的重链可变区序列前面加上了BstXI和BsmBI的酶切序列和信号肽序列、在贝伐单抗的轻链可变区序列前面加上SfiI的酶切序列和信号肽序列,并且进行了人类密码子偏向性优化以及基因表达的优化。经过优化,贝代单(?)重链可变区碱基序列的密码子适应指数(CAI)从0.80提高到0.87,最优密码子使用频率(FOP)也得到了优化,而GC含量变化不大；轻链可变区碱基序列的密码子适应指数(CAI)从0.80提高到0.85,最优密码子使用频率(FOP)也得到了优化,而GC含量变化不大。通过与前面构建好的三个抗体库进行链置换,构建了库容量分别为7.58x105和1.33×106,背景克隆的比例分别为2.51%和1.37%的全长人源抗VEGF抗体库。将抗体库瞬时转染293T细胞后,在细胞表面可以检测到全长人源抗VEGF抗体的表达；在抗VEGF抗体库1中,有22%的细胞表面可成功展示可被检测到的全长抗体,在抗VEGF抗体库2中,有28.05%的细胞表面可成功展示可被检测到的全长抗体。结论：成功在贝伐单抗的重链可变区序列和轻链可变区序列的前面加上了相应的酶切序列和信号肽序列并进行优化、全基因合成与制备,与前面构建好的三个抗体库基因进行链置换,构建了全长人源抗VEGF抗体基因库,将抗体库瞬时转染293T细胞后,在细胞表面可以检测到全长人源抗VEGF抗体的表达,为进一步利用贝伐单抗的抗VEGF导向选择作用,以便筛选具有与贝伐单抗相同的抗原亲和性和抗原结合表位的全长人源抗VEGF抗体做好了准备,也为开展全长人源抗VEGF单抗靶向治疗转移性肾癌奠定了实验基础。