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DNA复制是生命现象最本质的内容,是由众多蛋白共同参与的能确保遗传信息精确及时传递的复杂的生物学过程。古菌是一类区别于真核生物与真细菌的第三域生命形式,最近的研究表明它们的DNA复制系统与真核生物类似,而且更为简单。因此,对古菌DNA复制的研究能够为最终阐明高等真核生物复杂的DNA复制机制提供重要线索。Cdc6和MCM是与真核生物DNA复制起始有关的两种蛋白。已经报道极端嗜热古菌硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的环状染色体含有三个活性复制原点,其基因组编码三个Orcl/Cdc6同源蛋白(SsoCdc6-1、-2和-3)和一个MCM复制性解旋酶同源蛋白(SsoMCM)。尽管硫化叶菌有巨大潜力作为一种模式菌株来研究真核生物的重要复制机制,但目前有关古菌和真核生物复制起始蛋白如何介导原点DNA的解链以及复制起始复合物形成等有关的分子细节还很不清楚。本研究依据硫磺矿硫化叶菌两个复制原点oriC1和oriC2的结构特征,设计了三组分别具有平端和分叉结构的特异性DNA底物,通过EMSA、细菌双杂交以及Pull-down/western blot等试验,对S.solfataricus三个Orc1/Cdc6同源物之间以及它们与MCM、polB1和SSB之间的物理和功能相互作用进行了系统的研究,主要取得了的以下四个方面的研究结果:1.三个SsoCdc6差异性结合原点特异性DNA分子:SsoCdc6-1和-3不仅以结构特异性而且以序列特异性方式结合原点DNA底物。SsoCdc6-1对oriC1起源的DNA底物有较高的结合活性,对其平端底物的结合能力略高于分叉底物。SsoCdc6-3对oriC2起源的两种结构的DNA底物都有较高的结合活性,低浓度下结合分叉底物的能力高于平端底物,高浓度下没有明显的差异。而SsoCdc6-2对于三组DNA底物的结合活性没有表现出明显的序列特异性,但总体对平端底物的结合能力低于分叉结构DNA。另外,利用EMSA实验分析我们发现三个SsoCdc6 C-末端WH结构域缺失的突变体在体外也能结合原点特异性DNA底物,但是比全长的蛋白结合能力明显减弱。我们推测不仅SsoCdc6 C-端WH结构域,N-端结构域和DNA序列也会影响它们结合DNA的能力。2.三个SsoCdc6可以通过其N-端催化结构域发生物理和功能相互作用并且这种相互作用对它们的原点DNA结合活性有调控作用:细菌双杂交和Pull-down/westernblot实验表明三个SsoCdc6之间可以通过其N-端结构域相互作用;EMSA试验表明SsoCdc6-1刺激SsoCdc6-3原点DNA结合活性,而且三者可能形成较大的SsoCdc6-1/SsoCdc6-3/DNA复合物。相反SsoCdc6-3和SsoCdc6-1都分别抑制SsoCdc6-2的DNA结合活性,而且SsoCdc6-1能和SsoCdc6-2相互作用形成大的SsoCdc6-1/SsoCdc6-2/DNA复合物。这些结果表明这些复制起始蛋白可能在功能上相互作用并调控彼此在原点上的集结,作为预复制复合体(Pre-RC)的组件共同发挥作用来调控DNA复制的起始。3.三个SsoCdc6通过不同的结构域和SsoMCM相互作用,并且这些相互作用在调控SsoMCM募集到原点DNA过程中起着重要的作用:细菌双杂交和Pull-down/western blot以及EMSA实验表明SsoCdc6-2通过其C-端结构域和SsoMCM相互作用,并促进SsoMCM加载到原点DNA上。相反,SsoCdc6-1和-3通过其N-端结构域和MCM相互作用,并抑制SsoMCM和原点DNA的结合。虽然三个SsoCdc6蛋白都可以和SsoMCM解旋酶相互作用,相对SsoCdc6-1和-3,SsoCdc6-2和SsoMCM的相互作用要更紧密一些,并可能在解旋酶加载方面起作用。4.细菌双杂交分析S.solfataricus Cdc6、DNA聚合酶polB1、MCM以及SSB之间的物理相互作用,结果表明:SsoCdc6-1△C/SsopolB1、SsoCdc6-3/SsopolB1、SsoCdc6-2/SsoSSB、SsoCdc6-3/SsoSSB、SsoSSB/SsoMCM、SsopolB1/SsoMCM和SsopolB1/SsoSSB之间存在物理相互作用。总结以上研究结果我们推测,S.solfaricus三个SsoCdc6在DNA复制早期过程中可能扮演不同角色,但它们之间能够相互协作共同调控DNA复制原点的起始。编码SsoCdc6-1和SsoCdc6-3的基因分别与复制原点oriC1和oriC2相邻,可能在特异性识别原点中起作用,因而可以是真核生物ORC和细菌DnaA的功能同源物;而SsoCdc6-2编码的基因与编码SsoMCM的基因相邻而不与任何一个复制原点相邻可能负责MCM的加载,因而可能是真核生物Cdc6和细菌DnaC的同源物。我们的这些重要的结论已经对古菌和真核生物DNA复制起始机理的认识提供了重要线索。