论文部分内容阅读
第一部分人肠神经节发育异常与巨细胞病毒感染之间相关性分析目的：探讨人肠神经节发育异常与巨细胞病毒感染之间的相关性。方法：随机选取2012年9月-2014年9月间我科的先天性巨结肠及同源病的30例患儿血标本及60份结肠标本(结肠标本包含近端肠神经节正常段结肠和远端肠神经节异常段结肠)作为肠神经节发育异常组；选取同时间段的因肠套叠肠坏死接受肠切除肠吻合的10例患儿血标本和10份结肠标本作为对照组。运用ELISA分析两组患儿血标本CMV-IgG和CMV-IgM阳性率,运用免疫组织化学方法检测两组患儿结肠标本中CMV晚期蛋白表达,运用免疫原位杂交技术检测两组患儿结肠标本中CMV-DNA,比较两组患儿结肠CMV感染的差异,同时明确CMV感染结肠的位置。结果：肠神经节发育异常组30例血标本中CMV-IgG抗体阳性者8例(26.7%),对照组血标本无阳性病例(P<0.05),CMV-IgM抗体两组均为阴性；肠神经节发育异常组结肠标本共60份,其中CMV晚期蛋白阳性13份(21.7%,其中6份为HD结肠标本,7份为HAD结肠标本,均表达在肠神经节异常段结肠),对照组结肠标本中均未检测到CMV晚期蛋白表达(P<0.05)；在肠神经节发育异常组中原位杂交技术检测到的CMV-DNA阳性率与CMV晚期蛋白阳性率重叠,对照组结肠中未检测到CMV-DNA。CMV-DNA与CMV晚期蛋白的阳性表达的位置不同,CMV晚期蛋白阳性表达主要集中于肠神经节发育异常段结肠黏膜层、黏膜下层以及小部分的肠肌层的血管内皮细胞,在近端正常的肠神经节内无表达,CMV-DNA在近端正常结肠段和远端异常段结肠的黏膜层、黏膜下层、肌层以及神经节均呈棕黄色阳性显色,尤其在肠神经节细胞中呈强阳性显色。结论：HCMV感染与肠道神经节细胞发育异常密切相关,可能是其发病的又重要因素。第二部分先天性MCMV感染致新生小鼠肠神经节发育异常模型的建立目的：建立先天性MCMV感染致新生鼠肠神经节细胞发育异常的模型。方法：将无MCMV感染6周龄的Balb/c小鼠按雌雄2：1合笼,根据阴栓判断孕鼠的受孕时间,选取小鼠胚胎后肠肠神经发育的起始时间点对孕鼠进行接种MCMV,在孕鼠受孕lld时行腹腔接种1ml不同浓度的MCMV病毒悬液,每种浓度5只孕鼠,观察不同浓度病毒剂量对孕鼠及胎鼠的影响,确定造模病毒浓度；确定造模病毒浓度后,选取造模所需的病毒浓度1ml,孕11d时接种造模浓度MCMV孕鼠作为模型组,含10只孕鼠,同样孕龄接种不含MCMV的细胞培养基1ml孕鼠作为对照组,含5只孕鼠,观察两组小鼠胚胎的存活率,新生小鼠的体重,同时运用PCR检测胎鼠结肠CMV-DNA,免疫组化了解新生鼠结肠MCMV蛋白的表达,原位杂交技术检测新生小鼠结肠CMV特异性核酸序列定位,观察胎鼠结肠神经嵴干细胞和新生小鼠肠神经节细胞的变化,来判断肠神经节细胞发育异常模型发生。结果：1×102PFU/ul浓度接种孕鼠腹腔后胎鼠肠道中检测不到MCMV,对孕鼠、胎鼠及新生鼠生长发育无明显影响：1×104PFU/ul浓度接种孕鼠后,在接种后36h内孕鼠全部死亡；1×103PFU/ul浓度的行孕鼠腹腔内注射后可导致孕鼠的产量降低,同时可造成存活新生小鼠肠道巨细胞病毒感染和肠神经节细胞发育异常的发生,确定造模MCMV浓度为1×103PFU/ul。造模浓度1×103PFU/ul接种的孕鼠为实验组,与对照组相比,实验组孕鼠在接种MCMV24小时内出现反应迟缓,食欲下降,活动减少,后逐渐恢复正常活动,同时观察实验组新生小鼠的体重明显低于对照组(P<0.05),实验组胎鼠及新生鼠肠管CMV晚期蛋白可检测到阳性表达,CMV-DNA原位杂交也呈阳性,孕鼠腹腔接种可造成胎鼠的先天性CMV感染；实验组孕鼠中检测到新生小鼠发生肠神经节发育异常的比例约14%,肠神经节发育异常模型新生小鼠与对照组新生小鼠相比,模型新生鼠腹胀明显,解剖发现结肠远端出现狭窄及近端扩张,病理特征主要表现为结肠远端肠神经节细胞数量减少(P<0.05)。结论：先天性CMV感染可造成肠神经节发育异常模型的发生,为进一步的CMV感染造成肠神经系统发育异常的机制研究奠定基础。第三部分先天性MCMV感染后细胞免疫在肠神经节发育异常中作用机制的初步探讨目的：初步探讨先天性MCMV感染后细胞免疫在小鼠肠神经节发育异常中的作用机制。方法：实验分先天性MCMV感染组和对照组,对两组胎鼠肠管进行解剖行离体培养,观察比较两组肠管的蠕动及存活时间情况,运用流式细胞学技术检测两组新生1d小鼠外周血效应性DC和CD8+CTL的差异,Western Blot方法检测两组胎鼠结肠组织特异性杀伤作用的细胞因子穿孔素和颗粒酶的表达水平；同时对小鼠胚胎GNCSCs进行分离、培养和鉴定,然后与MCMV共培养,运用Western Blot共培养后48h后GNCSCs的分子MHC-Ⅰ、Fas、TNFR1表达水平变化。结果：与对照组相比,先天性MCMV感染的实验组胎鼠肠体外培养的蠕动明显减弱,平均生长时间较正常对照组缩短(P<0.05),MCMV感染模型组1d小鼠的外周血CD8+CTL和效应DC的比例增高(P<0.05),模型小鼠胚胎结肠组织穿孔素和颗粒酶的表达量明显上升(P<0.05)；GNCSCs与MCMV共培养后48h,与对照组比较,其形态及生长并无明显改变,但其表面分子MHC-Ⅰ、Fas和TNFR1表达量上调(P<0.05)。结论：先天性CMV感染胚胎后,诱导效应DC和CD8+CTL增殖,胚胎肠道的GNCSCs的MHC-Ⅰ、Fas和TNFR1分子表达上调,可促使GNCSCs被CD8+CTL特异性识别结合诱导其凋亡,同时也可能通过CTL的细胞毒性颗粒穿孔素和颗粒酶在经典穿孔途径下造成GNCSCs坏死,造成GNCSCs发育障碍,从而导致肠神经节发育异常。