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骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是广泛存在于骨组织内的多潜能成体干细胞,具有较强的自我更新和多向分化潜能,在干细胞研究中具有重要作用。自BMSCs被发现以来,在人和小鼠中已开展了大量研究,其体外分离、纯化、培养体系已基本建立。而在大动物如牛中,关于BMSCs的研究相对较少,在体外培养、表型鉴定方面仍存有争议,在其体外培养过程中,随传代次数的增多,细胞增殖能力会逐渐减退,伴随而来的还有细胞衰老、多能性丢失等诸多问题。本试验针对以上问题,首先通过全骨髓细胞分离、血细胞裂解以及贴壁纯化培养的方法分离得到胎牛骨髓间充质干细胞(bovine BMSCs,bBMSCs),并通过免疫染色、流式鉴定、多向诱导分化等方法验证其生物学特性。结果显示,分离得到的细胞确为bBMSCs,有较强的克隆增殖能力;免疫荧光染色结果显示bBMSCs能够表达间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)相关阳性标记分子CD73、CD90、CD105,同时不表达阴性标记分子CD34、CD45,且流式细胞分析进一步确证其纯度可达90%以上;诱导分化实验结果证明bBMSCs具有较强多向分化潜能。为优化bBMSCs体外培养条件,本研究通过改变基础培养基中的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和血清替代物(knockout serum replacement,KSR)浓度,设定了四种FBS-KSR组合培养基。通过测定不同浓度FBS-KSR组合条件下细胞的增殖水平证明,降低FBS并添加KSR有利于bBMSCs的体外增殖,适当浓度FBS-KSR可提高bBMSCs增殖相关基因的表达。此外,KSR还可促进抗凋亡基因Bcl2及多能性基因Oct4、Sox2的表达。值得注意的是,当完全去除FBS而以KSR替代时,bBMSCs的增殖会发生停滞。以上结果说明KSR可以提高bBMSCs体外增殖及多潜能性,但由于FBS中可能存在某种尚不明确的bBMSCs增殖所必需的成分,因而KSR并不能完全取代FBS。有研究表明,Repsox作为TGF-β受体ALK5的选择性抑制剂,在多能干细胞的诱导和多能性维持方面至关重要。对于bBMSCs而言,Repsox能否优化其干细胞特性,提高细胞增殖及多能性尚未见报道。本试验发现Repsox处理后,bBMSCs增殖基因、多能性基因表达水平均发生显著上调,成骨分化潜能显著提高,而成软骨分化潜能显著降低。本研究通过对bBMSCs进行分离鉴定、体外培养、培养条件优化,确定了bBMSCs的生物学特性和添加KSR的优化培养效果;进一步利用Repsox处理细胞,探究其对bBMSCs增殖及多能性的影响,旨在为bBMSCs的体外培养体系优化、干细胞特性研究及重编程诱导机制探究等方面提供一定借鉴,为其进一步的应用奠定基础。