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背 景 和 目 的肝癌的侵袭转移以及门静脉癌栓的形成是影响患者预后的重要因素,深入研究其机制对于改善肝癌患者的总体预后有重要作用。肝癌的侵袭转移以及门静脉癌栓的形成是一个多步骤、多环节共同参与的过程,包括原发瘤脱落、进入血管的肿瘤细胞聚集成微瘤栓以及与内皮细胞粘附着床并形成转移灶。进入血管内的肿瘤细胞其肿瘤细胞间的同型粘附和肿瘤细胞与血管内皮细胞以及血液细胞的异型粘附均增强,促进肿瘤微癌栓的形成。而相对于单个细胞,肿瘤微癌栓更易于在循环系统中存活并着床,更加利于肿瘤侵袭转移和门静脉癌栓的形成。因此,研究肿瘤细胞粘附的相关机制对于了解肿瘤侵袭转移和门静脉癌栓形成是十分必要的。在细胞的粘附侵袭过程中,粘附分子介导的跨膜信号传导引起细胞骨架的重排,从而调节细胞膜表面分子的分布,并形成更加稳固的粘着结构。抑制细胞骨架的重排能够阻断细胞表面分子分布的改变,从而抑制细胞的运动、粘附和侵袭能力。因此,有必要深入研究肿瘤细胞粘附过程中粘附分子和细胞骨架的相应改变。Ezrin是一种胞浆内细胞骨架连接蛋白,研究表明,在多种肿瘤如胰腺癌、前列腺癌、肺癌等中,Ezrin高表达,而且Ezrin在肿瘤侵袭前缘表达增强,转移灶Ezrin表达明显高于原发灶,表明其表达水平与肿瘤侵袭相关。在细胞系方面的研究也得出了相应的结论,Khanna等运用cDNA microarrays技术检测鼠骨肉瘤转移相关基因时发现,高转移的K7M2细胞株Ezrin表达量是低转移的K12的3倍。同样,高侵袭的胰腺癌细胞系、卵巢上皮癌细胞系、食管癌细胞系Ezrin表达水平远高于相应低侵袭的细胞系。高表达Ezrin的细胞系在体内更易于侵犯软组织、系膜和胰腺表现更高的侵袭特性。同时,抑制Ezrin的活化或运用反义寡核苷酸技术抑制肿瘤细胞的Ezrin表达后,肿瘤细胞肺转移率明显下降,体外侵袭性显著降低。 <WP=5>目前关于Ezrin参与肿瘤粘附转移侵袭方面的研究,主要侧重于Ezrin在肿瘤中的表达与肿瘤侵袭的关系、Ezrin与多种细胞表面粘附分子的结合以及与Ezrin相关的后续信号传导途径方面,而关于Ezrin与肝癌侵袭、门静脉癌栓形成的关系及其机制尚无明确报道,也较少关于Ezrin参与细胞膜表面粘附分子聚集的研究。Ezrin蛋白可以通过多种途径调节细胞骨架的改变,参与肿瘤细胞粘附和侵袭。活化的Ezrin蛋白分子C端与肌动蛋白微丝侧端结合后能够促进肌动蛋白聚合,促进肌动蛋白微丝(F-actin)延伸,从而调节局部肌动蛋白细胞骨架的重建,参与细胞的各项活动。另外,活化的Ezrin分子能够激活Rho蛋白酶,而Rho蛋白酶也是调节肌动蛋白细胞骨架重建的关键分子。脂质体转染反义寡核苷酸是一种成熟有效的基因干扰技术,通过脂质体将人工合成的能够与目标基因mRNA特定序列结合寡核苷酸导入细胞内,抑制目的基因mRNA翻译过程,从而抑制目的基因的表达。各种研究表明,选择适当的脂质体和设计良好的反义寡核苷酸能够显著抑制相应基因的表达水平。细胞松弛素D能够抑制肌动蛋白的聚合,从而能够抑制肌动蛋白微丝(F-actin)延伸,抑制肌动蛋白细胞骨架的重建。材 料 和 方 法人肝癌细胞株MHCC97L、MHCC97H、LM3(均由复旦大学肝癌研究所建立,三者均自肝癌细胞系LCID20分离所得,遗传背景相同但侵袭能力依次增加)。收集我所2002年病理诊断为肝细胞肝癌的手术切除标本41例及相应癌旁肝组织和9例同期良性肝病肝组织。应用RT-PCR、Western blot和免疫组化技术检测不同侵袭潜能肝癌细胞系和肝癌组织标本的Ezrin mRNA和蛋白表达水平及分布,并运用脂质体转染反义寡核苷酸MHCC97H细胞Ezrin表达,比较转染前后细胞粘附、运动和侵袭能力的改变,并且运用双重免疫荧光技术观察粘附过程中Ezrin和细胞表面粘附分子分布改变,运用反义寡核苷酸和细胞松弛素D抑制Ezrin和肌动蛋白聚合,比较Ezrin和细胞表面粘附分子的分布改变。<WP=6>结 果RT-PCR检测Ezrin mRNA在肝癌细胞系和肝癌组织中的表达不同侵袭能力肝癌组织表达水平差别较大。三株肝癌细胞系均表达Ezrin mRNA,但表达水平有明显差异MHCC97L、MHCC97H、LM3分别为1.2441±0.1883、1.9921±0.0379、2.5567±0.1829,与侵袭潜能呈明显正相关(P<0.01)。9例良性肝病肝组织Ezrin/β-actin平均值为0.6012±0.1672,41例癌周肝组织Ezrin/β-actin平均值为0.6841±0.2061,12例低侵袭肝细胞肝癌其癌组织Ezrin/β-actin平均值为0.7116±0.1486,29例高侵袭肝细胞肝癌组织Ezrin/β-actin平均值为0.9764±0.2148,癌栓组织Ezrin/β-actin平均值为1.1225±0.3543。统计学检验表明,癌组织表达显著高于癌周肝组织(P<0.01),合并门静脉癌栓的高侵袭性肝癌组织表达显著高于低侵袭性肝癌组织,(P<0.05)。癌栓组织表达高于相应癌组织(P<0.05)。Western blot检测不同肝癌细胞系和肝癌组织中Ezrin 蛋白表达MHCC97L、MHCC97H、LM3三株细胞系均表达Ezrin蛋白,其表达量随肿瘤侵袭性增强而依次增加。29例高侵袭肝细胞肝癌中26例癌组织呈阳性(89.7%),其中16例合并肉眼门静脉癌栓者中15例阳性(93.8%),13例无门静脉癌栓者11例阳性(84.6%)。12例低侵袭肝细胞肝癌中7例肿瘤组织呈阳性(58.3%)。9例良性肝病肝组织中3例阳性(33.3%)