【摘 要】
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低温不仅影响葡萄植株正常生长,也影响葡萄产量与品质。因此,筛选葡萄抗寒相关基因具有重要的研究意义。前人研究发现GPCR型G蛋白主要参与低温应答和植株株高发育调控进程。葡萄COLD1蛋白在低温信号通路中的功能尚未报道。本研究克隆了葡萄中的VvCOLD1基因,分析了VvCOLD1基因表达的组织特异性以及在低温和ABA处理下的表达模式,在模式植物拟南芥中异源过表达VvCOLD1初步探究其抗寒功能,筛选验
【基金项目】
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自然科学基金（32072554）; 国家重点研发计划课题（2019YFD1001405-3、2020YFD1000204）
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低温不仅影响葡萄植株正常生长,也影响葡萄产量与品质。因此,筛选葡萄抗寒相关基因具有重要的研究意义。前人研究发现GPCR型G蛋白主要参与低温应答和植株株高发育调控进程。葡萄COLD1蛋白在低温信号通路中的功能尚未报道。本研究克隆了葡萄中的VvCOLD1基因,分析了VvCOLD1基因表达的组织特异性以及在低温和ABA处理下的表达模式,在模式植物拟南芥中异源过表达VvCOLD1初步探究其抗寒功能,筛选验证了调控VvCOLD1的转录因子以及与VvCOLD1互作的蛋白。利用酵母单杂交和双荧光素酶实验筛选验证了调控VvCBFs表达的转录因子,初步分析了调控VvCBFs基因的转录因子在低温下的表达模式。主要取得了以下5个方面的结果:1.葡萄VvCOLD1基因的克隆与表达分析。从无核白和北冰红中克隆得到VvCOLD1基因,核苷酸长度为1407 bp,编码468个氨基酸。两个葡萄品种的COLD1蛋白第187位氨基酸均为甲硫氨酸（Met）,与不抗寒的籼稻一致。实时荧光定量PCR分析表明,VvCOLD1在无核白和北冰红的根、茎、叶、花和卷须中均有表达,表达量在北冰红的成熟叶片中最高。4℃低温处理后,无核白和北冰红中VvCOLD1基因表达量在0.5 h内被抑制,随后升高,于3 h达到表达峰值;ABA处理后,VvCOLD1基因在无核白和北冰红中均被抑制表达。2.葡萄VvCOLD1基因抗寒功能验证。构建VvCOLD1过表达载体,利用拟南芥遗传转化技术获得了拟南芥纯合过表达株系VvCOLD1-OE,并对其进行了冷冻表型分析和q RT-PCR分析。经-10℃冷冻胁迫处理后,与野生型相比,VvCOLD1过表达植株死亡较少,而atgtg1和atgtg2突变体植株死亡现象比较严重。4℃低温处理48 h后,实时荧光定量PCR分析表明冷响应基因CBF1、CBF2、COR47和COR15的表达水平在VvCOLD1过表达植株中显著高于野生型,在atgtg1和atgtg2突变体中显著低于野生型。3.葡萄VvCOLD1蛋白与G蛋白α亚基Vv Gα互作。通过PCR扩增从无核白中得到了Vv Gα和VvCOLD1基因的CDS序列,利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补实验（Bi FC）验证出VvCOLD1与葡萄Vv Gα基因编码蛋白存在互作。q RT-PCR分析发现葡萄Vv Gα在根、茎、叶、花和卷须中均有表达,4℃低温处理诱导了葡萄中Vv Gα的基因表达。4.葡萄抗寒关键转录因子VvCBFs转录因子负调控VvCOLD1基因表达。从无核白中克隆了葡萄VvCOLD1基因的启动子片段以及VvCBFs转录因子的CDS序列,顺式作用元件分析发现VvCOLD1启动子区域含有抗寒相关转录因子CBF的结合元件CRT/DRE。酵母单杂交实验结果表明VvCBF1和VvCBF4转录因子可以结合到VvCOLD1启动子区域的CRT/DRE作用元件,双荧光素酶实验表明VvCBF1、VvCBF2、VvCBF3和VvCBF4转录因子抑制VvCOLD1启动子的活性。5.筛选调控葡萄VvCBFs基因表达的转录因子。通过PCR扩增从无核白中得到了葡萄VvCBFs基因上游的启动子片段以及候选转录因子的CDS序列。利用双荧光素酶和酵母单杂交实验验证发现:（1）Vv MYB24和Vv MYB44与VvCBF1启动子互作,Vv MYB24在22℃条件下对VvCBF1启动子活性具有激活作用;（2）Vv ZAT10、Vv ZAT11、Vv MYB24、Vv MYB44、VvCBF1和VvCBF4与VvCBF2启动子互作,Vv ZAT10、Vv MYB24、Vv MYB44和Vv ZAT10对VvCBF2启动子活性具有抑制作用,Vv ZAT11和VvCBF4对VvCBF2启动子活性具有激活作用;（3）Vv ZAT11、Vv MYB24、Vv MYB44和Vv WRKY75与VvCBF3启动子互作,Vv MYB24和Vv ZAT12对VvCBF3启动子活性具有抑制作用;（4）Vv ZAT10、Vv ZAT12、Vv MYB24和Vv MYB44与VvCBF4启动子互作,Vv ZAT10和Vv ZAT12对VvCBF4启动子活性具有激活作用,Vv MYB24和Vv MYB44对VvCBF4启动子活性具有抑制作用。实时荧光定量PCR分析表明4℃低温处理下,转录因子Vv ZAT10、Vv ZAT11、Vv ZAT12、Vv MYB24和Vv MYB44基因均被低温诱导表达。
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