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目的:
采用乙醇加热回流提取制备出金银花单提、连翘单提、混合提取、单提合并共四种注射液。以高效液相色谱仪分析四种注射液中主要成分绿原酸、咖啡酸和连翘苷含量,应用在体和离体试验比较药效学差异,并通过建立高效液相色谱法对绿原酸和连翘苷在家兔体内的药动学过程进行研究,以评价金银花、连翘药对混提注射液、单提合并注射液及单提注射液的药效与药动学差异,从而为合理使用银翘药对提供理论依据。
方法:
1.以10倍体积量,75％乙醇,提取3次,每次0.5h作为金银花、连翘提取工艺,制备得金银花单提(A组)、连翘单提(D组)、混合提取(B组)、单提合并(C组)4种注射液。
2.建立银翘药对中主要成分绿原酸、咖啡酸、连翘苷的HPLC含量测定方法。
3.采用试管二倍稀释法测定四种注射液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、停乳链球菌的MIC和MBC值。
4.制造二甲苯致健康小鼠非特异性炎症模型,比较4种注射液的抗炎效果差异。
5.建立血液中绿原酸、连翘苷的HPLC分析方法,并测定4种注射液中绿原酸、连翘苷两种主要成分在家兔体内不同时间点的血药浓度,药时数据通过MCPKP药动学软件分析,计算药代动力学参数。
结果:
1.制备得到4种注射液,A组中绿原酸含量为4.295 mg·ml-1,B组中绿原酸、连翘苷含量分别为4.862 mg·ml-1、3.10 mg·ml-1,C组中绿原酸、连翘苷含量分别为4.269 mg·ml-1、2.40mg·ml-1,D组中连翘苷含量为2.307 mg·ml-1。
2.绿原酸、咖啡酸和连翘苷分别在下列范围内呈现良好的线性:0.076～1.52μg(r=0.9998)、0.012～0.23μg(r=0.9999)和0.04～0.86μg(r=0.9999),平均加样回收率分别为99.41％(RSD1.52％)、102.91％(RSD2.67％)和101.06％(RSD2.45％)。4种注射液中三种成分含量比较结果为,绿原酸:B>A>C;连翘苷:B>C>D,咖啡酸:B>C>D。
3.体外抑菌试验结果,A、D、C、B4种注射液对金黄色葡萄球菌的MIC为70g·l-1、70.3g·l-1、21.8g·l-1、21.8g·l-1,MBC为70g·l-1、70.3g·l-1、21.8g·l-1、21.8g·l-1；对大肠杆菌的MIC为140g·l-1、281.3g·l-1、87.5g·l-1、87.5g·l-1,MBC为140g·l-1、281.3g·l-1、175g·l-1、87.5g·l-1；对无乳链球菌的MIC为70g·l-1、140.6g·l-1、175g·l-1、87.5g·l-1,MBC为140g·l-1、281.3g·l-1、175g·l-1、175g·l-1；对停乳链球菌的MIC为70g·l-1、140.6g·l-1、87.5g·l-1、87.5g·l-1,MBC为70g·l-1、281.3g·l-1、175g·l-1、175g·l-1。混合提取与单一提取合并注射液在抗菌活性上无明显差异。
4.四种注射液抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀结果为:B>C>D>A。
5.健康家兔肌注A、B、C3种注射液后,绿原酸在家兔体内的药动学过程符合一级吸收二室模型,绿原酸的主要药动学参数如下,A、B、C3注射液的Cmax分别为1.567±0.211mg·l-1、1.656±0.143mg·l-1、1.612±0.175mg·l-1:Tmax分别为0.413±0.076h、0.224±0.051h、0.285±0.085h;Vd分别为1.895±0.382L·kg-1、1.729±0.413L·kg-1、1.786±0.261L·kg-1；消除半衰期分别为1.164±0.136h、1.227±0.204h、1.132±0.186h；体清除率分别为1.128±0.236L·kg-1.h、0.927±0.113L·kg-1·h、1.010±0.142L·kg-1·h;AUC分别1.905±0.303 mg·h·L-1、2.623±0.267 mg·h·L-1、2.114±0.312 mg·h·L-1。
健康家兔肌注B、C、D3种注射液后,连翘苷在家兔体内的药动学过程符合一室模型,连翘苷的主要药动学参数如下,B、C、D3种注射液的Cmax分别为1.902±0.416mg·L-1、1.858±0.360mg·L-1、1.548±0.231mg·L-1；Tmax分别为0.606±0.172h、0.646±0.116h、0.742±0.110h;Vd分别为0.682±0.158L·kg-1、0.734±0.121 L·kg-1、0.748±0.191L·kg-1；消除半衰期分别为1.212±0.176h、1.220±0.182h、1.272±0.207h;体清除率分别为0.396±0.092L·kg-1·h、0.417±0.130L·kg-1·h、0.425±0.111 L·kg-1·h；AUC分别为3.216±0.542 mg·h·L-1、2.881±0.432 mg·h·L-1、2.80±0.314 mg·h·L-1。
结论:
1.金银花、连翘混合提取后,其主要成分绿原酸和连翘苷的溶出率都显著高于单一提取和单提合并。
2.混合提取与单提合并注射液在抗菌活性上无明显差异,混提与两者单提在抑菌上表现为相加作用。
3.在高剂量时,C组注射液与B组注射液抗炎无显著差异(P>0.05),B组、C组注射液与A组注射液呈现差异极显著(P<0.01),C组与D组注射液差异不显著(P>0.05),B组与D组注射液差异显著(0.010.05)。组间比较时,只有B组与A组注射液差异显著(0.010.05)。
4.家兔肌注A组、B组、C组注射液后,绿原酸在家兔体内的药动学过程均符合一级吸收二室模型。肌注B、C、D3种注射液后,连翘苷在家兔体内的药动学过程符合一室模型。B、C注射液中绿原酸、连翘苷的Tmax、Lα/2、T1/2ka与单煎相比呈差异显著性,Tβ/2差异不显著,表明B、C中绿原酸与连翘苷在注射后能很快的在体内吸收分布,达到血峰浓度,两者对消除半衰期的影响不大。B与C中绿原酸与连翘苷的药动学参数差异不显著。
总之,B与C在体外抑菌、抗炎,家兔体内药动学参数无显著性差异,B组注射液抑菌效果、抗炎作用稍强于C组注射,这与家兔体内的药动学数据一致,可能混合提取与单一提取合并无新物质产生或者新物质产生较少,对药效学与药动学作用不明显。