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禽流感(Avian Influenza,AI)是由禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)引起的流行性感冒。AIV不仅会造成禽类感染,为养殖业带来巨大损失,而且它能够突破种属屏障造成哺乳动物的感染如小鼠、豚鼠、雪貂、恒河猴、家犬、家猫等。自1997年首次报道人类感染病例至今,不断有AIV感染人事件的报道,如H1N1、H5N1、H7N2、H9N2亚型AIV以及新型H7N9亚型AIV感染人事件,对公共卫生和人类健康构成威胁,成为一种新发人兽共患传染病。H9N2亚型AIV,它在世界范围内流行广泛,不仅给养殖业带来了巨大的经济损失,同时也可造成人类的感染,引起死亡。H7N9亚型AIV自2013年2月在中国上海、安徽等地发现以来,截止到2015年2月共有571例感染,212人死亡。目前虽然尚未发现人传人的证据,但是它的流行给人们以警示,特别要重视动物源性人兽共患病,须从根源上控制AI的爆发流行。本研究使用实时荧光定量RT-PCR方法对活禽市场和养鸡场环境内H7N9和H9亚型AIV气溶胶进行检测。针对H7N9亚型欧亚谱系AIV的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因的序列保守区分别设计选择特异性引物和TaqMan探针。通过优化反应条件,建立了H7N9亚型AIV实时荧光定量RT-PCR检测方法。根据本实验室吕静(2011)建立的H9亚型AIV实时荧光定量RT-PCR方法,建立H9亚型AIV的标准曲线。使用大气颗粒物采样器和AGI-30采样器对空气样品进行采样,对样品进行H7N9和H9亚型AIV气溶胶的检测。结果显示,本试验建立的H7N9亚型AIV实时荧光定量RT-PCR方法,H7和N9基因的最低检测限度分别为100 copies/μL和101 copies/μL,R2值均为0.999。批内和批间试验的变异系数均小于3%,重复性好。可用于空气中H7N9亚型AIV的检测。建立的H9亚型AIV的标准曲线,R2值为0.999。可实现对空气中H9亚型AIV的检测。使用大气颗粒物采样器和AGI-30采样器对活禽市场空气样品进行为期11个月的监测。其中,使用大气颗粒物采样器主要针对气溶胶中大气颗粒物空气动力学直径≤2.5μm的细颗粒物(fine particulate matter,PM 2.5),收集样品33份,AGI-30收集气溶胶中存在的不同粒径的颗粒物,收集样品99份。使用本实验所建立的H7N9亚型AIV实时荧光定量RT-PCR方法进行检测发现,在大气颗粒物采样器收集到的空气样品中存在3份H7N9阳性分别是2014年7月,2015年2月和3月,浓度分别为1.06 copies/μL、1.06copies/μL、1.46 copies/μL,根据空气中病毒浓度计算公式,活禽市场空气中H7亚型AIV的浓度为1.23×10-1copies/m3 air、1.23×10-1copies/m3 air、1.69×10-1copies/m3 air。使用H7亚型检测试剂盒检测,结果阳性。对H7阳性样品进行N9检测,结果阳性,浓度为13.49copies/μL、11.06 copies/μL、11.54 copies/μL,根据空气中病毒浓度计算公式,活禽市场空气中N9亚型AIV的浓度为1.56 copies/m3 air、1.28 copies/m3 air、1.34 copies/m3 air。其它月份均未检测到,AGI-30所收集样品均未检测到阳性。对活禽市场进行H9亚型AIV的检测结果显示,大气颗粒物采样器收集空气样品每一份均可检测出H9亚型AIV阳性。浓度在1.45×102 copies/μL~7.43×104copies/μL。根据空气中病毒浓度计算公式,活禽市场空气中PM 2.5气载H9亚型AIV的浓度为1.68×101~8.60×103copies/m3空气。对使用AGI-30采样器收集到的空气样品检测显示,每个月都能检测到H9亚型的AIV,浓度在1.41×102 copies/μL~9.06×102 copies/μL。据计算,活禽市场空气颗粒物中气载H9亚型AIV的浓度为1.07×104~6.89×104copies/m3air。两种采样器收集的气溶胶粒径大小虽然不同,但是在监测时间内H9亚型AIV的变化趋势是一致的,分别在2014年7月、2014年12月和2015年2月呈高峰趋势。活禽市场空气中存在H9亚型AIV的粒子,而且长时间存在。对泰安市岱岳区的五个养鸡场的鸡舍进行空气样品和粪便样品的采样。对其进行H7N9亚型AIV的检测,结果阴性,也未见H7N9亚型AIV的感染病例。对H9亚型AIV检测发现,A、D两养鸡场空气样品中H9亚型AIV检测结果阴性,B、C和E三个养鸡场空气样品阳性,浓度分别为1.50×102 copies/μL、1.70×102 copies/μL、1.84×102copies/μL,根据空气中病毒浓度计算公式,养殖舍内空气中气载H9亚型AIV的浓度为1.14×104copies/m3air、1.29×104 copies/m3 air、1.40×104 copies/m3 air。每个养殖场均检测到粪便样品阳性,阳性率为6.25%~13.80%。以上数据显示H9亚型AIV存在于养鸡场空气及禽类的粪便中,虽然浓度不高,但是不排除感染人的风险。