烟草植株的地上部分密集着腺毛,这对烟草植株的抗性和烟叶的品质有重要影响。栽培烟草的腺毛主要由长柄分泌型、短柄分泌型、非分泌型混合组成,三种不同类型的腺毛对烟草都有着其重要作用。本文克隆了本文克隆、分析NtCycB2,构建载体,进行过表达与敲除的研究,遗传转化,通过对转基因株系腺毛形态观察,阐明NtCycB2基因表达对烟草腺毛发生的影响。主要研究结果如下:1、克隆K326中的NtCycB2 cDNA序列,测序,该基因编码区长度为333bp,共存在NtCycB2-1与NtCycB2-2两个拷贝,核苷酸同源性是94%,氨基酸相同。蛋白分析,NtCycB2编码氨基酸110个。蛋白序列比对分析结果表明NtCycB2蛋白序列与其他品种烟草大致相同,而与本氏烟蛋白序列的同源性不相同,与番茄、拟南芥蛋白序列的同源性较远。系统进化树分析结果也表明,CycB2在不同栽培烟草、亲本之间高度保守,但与本氏烟NbCycB2大为不同,与番茄SlCycB2、拟南芥AtCycB2的亲缘关系甚远。2、不同组织:根部、茎部、叶片、刷去腺毛叶片、刷取的腺毛和花朵。分析发现,NtCycB2在腺毛和花中的表达达到顶峰,约为该基因根部表达量的7.57倍和5.18倍。但是它在根部和茎部中表达量却相对较低,而在叶片中得含量相对来说是较高的,但是在刷去腺毛叶片中含量骤然减少,明显降低。由此我们可以推测,该基因高量表达是在烟草的刷取的腺毛中,这同番茄SlCycB2在其腺毛中高量表达的结果是相一致的。。3、实时定量,分析5种胁迫,盐、干旱、温度、MeJA对NtCycB2表达响应。在模拟干旱和盐胁迫下,NtCycB2降低,在干旱和盐胁迫下是受到抑制的。42℃条件,随时间增长,NtCycB2表达量呈现逐渐增加的趋势,而在4℃胁迫下,该基因表达量整体逐渐降低,表明NtCycB2在不同温度下会受到一定的诱导。在对激素MeJA应答下,处理的12h时NtCycB2表达量猛然增加,骤增明显,显著降低在24h时,说明了在MeJA的胁迫下,该基因表达量随时间处理的增加而表现不同。4、构建过表达载体pCXSN-FLAG-NtCycB2和基因编辑载体NtCycB2-knockout。侵染烟草K326,分别使用荧光定量和测序分析筛选出的过表达、敲除株系。超量表达株系NtCycB2是K326的3.08倍,纯化后的PCR产物就经测序发现4株敲除株系中gRNA区域发生纯合突变。5、腺毛形态观察:NtCycB2过表达植株茎部和叶片无毛状,仅有少量短柄分泌型腺毛,其余消失不见;而NtCycB2敲除植株中茎部与叶片多毛,分泌型腺毛增加,非分泌型腺毛无变化。说明NtCycB2负向调控烟草分泌型腺毛。