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目的：通过体外传代培养人类肝癌SMMC-7721细胞,以不同时间、不同浓度的维生素K3对其进行凋亡的诱导,观察药物作用后细胞的形态变化,用流式细胞仪分析诱导凋亡的细胞周期、凋亡比率的变化情况,同时检测与肝癌细胞凋亡相关的热点分子端粒酶催化亚单位(hTERT)、survivin、Fas、caspase3 mRNA水平的表达,从细胞分子生物学水平来观察各个因子在凋亡发生过程中的变化,以及相互之间的关系,初步探讨维生素K3诱导肝癌细胞凋亡的机制,从而为临床肝癌治疗提供理论依据.
方法：本实验人类肝癌细胞株SMMC-7721购自中国武汉典型培养物保藏中心,主要步骤包括:
1.人类肝癌细胞株SMMC-7721的维持及扩大培养.
2.选取对数生长期的肝癌细胞以不同浓度、不同时间的维生素K3进行诱导.
3.Hoechst33342荧光染色法激光共聚焦显微镜下观察凋亡细胞核形态.
4.CCK-8法检测维生素K3对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用.
5.用流式细胞仪检测细胞凋亡率(Anrlexin V/PI法)、细胞周期和细胞膜表面Fas的表达.
6.RT-PCR法检测细胞hTERT、survivin、Fas、caspase3 mRNA的表达.
7.分析上述指标在细胞凋亡过程中的变化及其相互关系.
结果：本实验结果总结如下:
1.肝癌细胞生长良好,呈贴壁生长,多为短梭形,生长迅速,三天传代一次,细胞生长密集时可多层重叠生长.
2.维生素K3诱导后的肝癌细胞,CCK-8法检测其活细胞比率下降,生长抑制率上升,呈明显的剂量依赖性.
3.维生素K3诱导后的肝癌细胞,Hoecst33342荧光染色发现细胞凋亡过程中早期凋亡细胞细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;中晚期凋亡细胞细胞核的染色质高度凝聚、边缘化,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体.
4.流式细胞仪检测发现,不同浓度VK3(2、5、10、20、25μmol/L)作用SMMC-7721细胞.48h后,细胞凋亡率分别是33.28﹪,63.97﹪,77.69﹪,87.30﹪,92.40﹪;SMMC-7721细胞膜表面Fas表位和细胞内Fas mRNA水平均呈先升后降的变化;细胞周期检测则发现G<,0>/G<,1>期细胞增加,S期细胞减少,细胞G<,0>/G<,1>期进程阻滞.
5.不同浓度VK3(2、5、10、20、25 μmol/L)作用SMMC-7721细胞48h后,RT-PCR法检测发现细胞hTERT、survivin mRNA水平逐渐降低,caspase3 mRNA水平逐渐升高,FasmRNA水平则呈先升后降的变化趋势.上述指标呈明显的剂量依赖性.
6.统计分析表明在维生素K3诱导细胞凋亡的过程中survivin mRNA变化趋势和caspase3、fasmRNA的变化趋势呈负相关.
结论：
1.维生素K3可以诱导肝癌细胞发生凋亡,呈明显的浓度剂量依赖性,以48小时作用最为明显.
2.Hoechst33342荧光染色法在凋亡细胞观察的应用中有很大的实用价值,能快速动态的观察凋亡细胞核变化的情况,并可进行定量和定性分析.
3.在维生素K3诱导细胞凋亡的过程中伴随着hTERT、survivin mRNA水平的下降和Fas、caspase3 mRNA水平的升高, survivin mRNA变化趋势和caspase3、fasmRNA的变化呈负相关,上述指标的联合检测有助于探讨维生素K3诱导肝癌细胞凋亡的分子机制.