蛇足石杉内生真菌的分离鉴定及菌株Cercospora lagenariae化学成分研究

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植物内生菌(Endophyte)是生活史的全部或部分阶段生活在植物体内部的微生物类群。内生菌能够产生结构新颖多样的代谢产物,是活性天然产物发现的重要资源,内生菌在同植物长时间互利共生的过程中由于遗传信息交换有可能产生同宿主植物相同或相似的代谢产物。中草药蛇足石杉中分离鉴定的石杉碱甲具有极强的乙酰胆碱酯酶抑制活性,治疗阿尔茨海默症(老年痴呆症)效果显著。石杉碱甲在蛇足石杉植株中含量极少,且生长缓慢,野生资源面临枯竭。近些年从蛇足石杉植株体内发现大量的不同种类的内生真菌,这些内生真菌代谢产物丰富多样,部分内生真菌还可以生成石杉碱甲而引起关注。因此,我们围绕蛇足石杉中的内生真菌进行分离纯化和鉴定及内生真菌的代谢产物进行系统研究,目前取得以下进展:1、从蛇足石杉植株体内分离纯化出了 101株内生真菌,经形态学筛选合并得到46个菌株,利用ITS测序对所纯化的内生真菌进行鉴定,鉴定出其中37个菌株,分属于10个属:其中刺盘孢属Colletotrichum sp.20株、节菱孢属Arthrinium sp.5株、芽枝霉属Ladosporium sp.3株、马拉色氏霉菌属Malassezia sp.1株、小丛壳菌属Glomerella sp.2株、柄孢壳菌属Podosporasp.1株、青霉属Penicillium sp.2株、球腔菌属Mycosphaerella sp.1株、尾孢菌属Cercospora sp.1株、亚球壳属Sphaerulina sp.1株。并利用MEGA6.0软件构建内了 37株内生真菌间的系统关系树。2、对46个菌株的发酵液提取物乙酸乙酯部位和菌丝提取物甲醇部位进行了乙酰胆碱酯酶抑制活性和对LPS诱导的RAW 264.7细胞中一氧化氮(NO)生成的抑制活性筛选。结果发现有 4 个菌株(Hupa-ZX-3、Hupa-ZX-7、Hupa-ZX-13、Hupa-ZX-45)表现出了乙酰胆碱酯酶抑制活性,共有25个菌株的发酵提取物对NO有抑制活性。3、由于菌株Hupa-ZX-45对乙酰胆碱酯酶和LPS诱导的RAW 264.7细胞中一氧化氮(NO)生成均具有较好抑制活性,故利用硅胶、凝胶柱色谱及半制备液相色谱等分离技术,以1HNMR为导向对菌株Hupa-ZX-45(Cercospora lagenariae)的糙米发酵产物进行了分离和结构鉴定,目前共鉴定9个化合物的结构:(12R)-penicimycosphaerella A(1)、alternariol(2)、alternariol 9-methyl ether(3)、nigrosporaol A(4)、alternarienonic acidB(5)、2-甲基-5-羧甲基-7-羟基色原酮(6)、2,5-dimethyl-7-hydroxychromone(7)、1-deoxyrubralactone(8)、(-)-Alternarlactam(9),其中化合物 1 为新化合物;药理活性筛选发现化合物6具有NO抑制活性,IC50 = 57.5 ± 1.2 μM。
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