论文部分内容阅读
鸡马立克氏病（MD）是由马立克氏病病毒（MDV）引起的一种淋巴组织增生性肿瘤疾病，常因造成免疫抑制和大批死亡而给养禽业带来巨大的经济损失。虽然常规疫苗在控制MD的发生中起到非常重要的作用，但也存在难以克服的缺点，常规的HVT冻干疫苗使用方便而免疫效力欠佳，常规的液氮冷冻疫苗保护效力高而保存和运输不方便。为了能研制新一代安全、高效、使用方便的基因工程疫苗，本研究对鸡痘病毒的复制非必需片段进行优选，对人工合成启动子进行组合筛选，以优选的复制非必需片段和强启动子构建了高效表达MDV gB基因的重组鸡痘病毒及共表达MDV gB和γ干扰素基因的重组鸡痘病毒（rFPV），并在不同品种鸡中测定了rFPV的免疫效力。现从五个方面将本论文进行的研究概述如下：一、鸡痘病毒复制非必需片段的优选 pSV-Gal经HindⅢ和BamHI双酶切回收β-半乳糖苷酶基因（LacZ）片段，插入到BamHI单酶切的质粒pp18中P7.5下游，构建成含P7.5-LacZ基因盒的pB7.5，以HindⅢ和XbaI双酶切pB7.5，回收P7.5-LacZ基因盒，插入到3个含鸡痘病毒复制非必需片段的质粒pFPV18、pFPV7s、pFPV9s的EcoRV位点构建成转移载体pFB18、pFB7s和pFB9s，以转移载体和脂质体共转染已感染FPV中国疫苗株282E4的鸡胚成纤维细胞（CEF），经多次蓝斑筛选和纯化，得到稳定生长的重组病毒；将纯化后的重组鸡痘病毒感染次代CEF，于感染后72小时收获细胞，制备细胞提取物，检测提取物中β-半乳糖苷酶的活性。通过比较活性的高低及片段长短的优势，我们选取了pFPV7s作为构建高效表达载体的复制非必需片段。经序列测定，该片段由2909个核苷酸组成，是新鉴定出的FPV复制非必需片段。 －d－ler。esn ie州大学博士学位论文二、鸡痘病毒强启动子的合成和筛选 根据痘苗病毒天然启动子P7．5的结构，考虑核昔酸的种类、数目、分布与启动效率之间的关系，人工合成一条寡核昔酸，经磷酸化，变性退火后各形成一个早期G）和一个晚期启动子（L），其首尾可相互连接；用 T4 DNA连接酶使早、晚期启动子自身连接或混合连接，将不同启动子的组合克隆到pUC t体中，通过原位杂交筛选，酶切、电泳及测序来确定启动子数目，获得了IO个较有代表性的启动子组合P81．10：PSI（L）、PSZ（LL）、PS3（LLLL）、Ps4（EE）、PSS（LE）、Ps6（LELE）、Ps7（LLEE）、Pss（LLEEEE）、Psg（LLES）和 Pslo（LLE18）。在质粒Psllo的不同启动子下游插入LacZ基因后，用BamHI和Hindlll双酶切回收PS－LacZ基因插人到含鸡痘病毒复制非必需片段的质粒pFPV7S形成转移载体pFBSllo，脂质体转染，蓝斑筛选和纯化得到重组病毒OFPVSllo）；以含P7．5－eZ基因的重组病毒为对照，含合成启动子的重组病毒于感染CEF后10、24、36、48、72小时收获细胞，制备细胞提取物，检测p－半乳糖昔酶的活性。通过活性强弱的比较，筛选出最强的启动子组合LLEE，其表达活性为P7．5的3．5倍。和其表达效率相近的启动子组合为LLLL。我们选用LLEE来构建高效表达载体。三～高效表达MDVgB＆因的重组鸡痘病毒的构建 人工合成2＆寡聚核昔酸，形成一个多克隆位点，与EcoRV＄切的pFPV7s相连形成含多克隆位点的yV7S；将pG18用BamHI酶切，回收PlllncL基因盒插入到含强启动子LLEE的PS的EcoAI位点构建pOS，使LLEE与Pll－eZ处于相对方向；再将 pGS中的 PSLacZPll基因盒插入到 FPV7S中构建成插入载体PFGSll 最后将 CVI988 gB基因插入到 pFGSll中的 PS下游构建成转移载体pFGBS，利用 PS来调控 MDV gB的表达；通过酶切和 SOUthern blot鉴定后，转染已感染 FPV 282E4的 CEF，经蓝斑筛选和纯化得到重组病毒rFPVPS－gB，以抗MDV gb单抗作间接免疫荧光试验可见感染重组病毒的CEF的细胞膜和细胞浆有特异性的黄绿色的荧光，与P7．5调控MDV gB基因表达的重组病毒dpVI7．5－gB相比，d7T，v－PS伊的gB基因的表达量是后者3倍以上。证明了优选的复制非必需片段可用于构建稳定的鸡痘病毒载体，筛选的强启动子可提高目的基因的表达量。四、共表达MDVgh和可干扰素基因（WN）的重组鸡痘病毒的构建 彭大新：表达 MDV gB基因及共表达 gB和鸡 Y干扰素基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护作用 f 将含 PE／LJFN基因盒的质粒用 EcoM酶切补平后插入到 pFGBS的 Smal位点， 通过酶切鉴定和斑点杂交获得了PEIJFN与PS唱B同向和相对的转移载体 pFGBSll和pFGBSIZ。选择pFGBSIZ经脂质体转染，蓝斑筛选纯化得到稳定的重 组病毒rFPVPS唱B工FNJ。以间接兔疫荧光法证实，LLEE调控的MDV gB可正