论文部分内容阅读
L-苯丙氨酸（L-Phe）是具有生理活性的芳香族氨基酸,是人和动物必需的氨基酸之一。其主要用于功能性食品添加剂阿斯巴甜的生产。目前,由于国内氨基酸大输液和抗癌药的开发利用,特别是对糖精生产实行限制,阿斯巴甜需求量激增,L-Phe的市场需求也相应增加。本文利用固定化粘红酵母细胞,以苯丙氨酸解氨酶（PAL）/肉桂酸途径制备L-Phe。并对固定化条件、固定化细胞部分酶活性质、效应因子和戊二醛化学修饰对固定化细胞酶活的影响、酶反应条件以及固定化细胞批式反应制备L-Phe进行了研究。由本实验室不同时期保存的10株粘红酵母菌出发,经过初筛和复筛,选出高PAL酶活性的Rhodotorula glutinis.06112-8-3菌株,作为本实验的供试菌。分别以琼脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、海藻酸钙作为粘红酵母细胞固定化的载体材料,通过对固定化后酶活回收率、载体机械强度等因素进行考察,最终确定聚丙烯酰胺作为本实验固定化细胞的载体材料。对固定化过程中的单体浓度、交联剂浓度、包埋浓度、包埋时间进行了单因素考察,以单因素实验结果为参考,用响应面法对固定化条件进行了优化。首先,用Plackett-Burman法设计实验对以上四个影响因素进行了评价,并筛选出显著影响因素——单体浓度和包埋浓度,第2步用最陡爬坡实验逼近以上两因素最优水平。最后由中心复合实验及响应面分析确定主要影响因素的最佳条件。固定化粘红酵母细胞的最优包埋条件为:单体浓度:16.7%;包埋浓度:43%;交联剂浓度:2.0%;包埋时间:45min。在此条件下得到的固定化细胞酶活保留率可达63%,较优化前提高了31%。考察了固定化细胞的部分酶学性质,并与游离细胞进行了对比。在热稳定性方面,固定化细胞与游离细胞基本一致,40℃保温时酶活较稳定,60℃保温条件F,酶活迅速丧失。对比反应时程曲线发现,固定化细胞的最大反应速率出现在4hr～8hr之间,较游离细胞出现了延滞。固定化后的细胞酶活稳定性明显增强,连续进行5个批次转化反应后仍保持一定的催化活性,而游离细胞第二次使用时酶活已经显著降低。固定化细胞中添加效应因子——山梨醇（α=18:1）,使用0.05%的戊二醛溶液后处理固定化细胞都可使固定化细胞酶活提高。二者联合使用使固定化细胞的酶活保留率和酶活稳定性大大提高。通过对固定化细胞酶反应条件的优化,确定最优的酶反应条件:pH为11的底物转化液体反应混合物中,NH4+浓度3.0mol/1,底物肉桂酸的浓度为13g/1,反应温度为30℃。初步研究了固定化细胞半连续批式转化肉桂酸制备L-Phe。固定化细胞经过10个批次的转化反应,大约有4.78g的肉桂酸在0.1L的半连续批式生物反应器中被固定了20g湿细胞（收获自1L摇瓶液体培养物）的固定化细胞生物转化,积累生成了5.33g的L-Phe;相当于在液体反应混合物中L-Phe的积累浓度达到了53.3g/1。这与该菌株的中试整细胞一次批式转化工艺水平30g/1比较,产率提高了1.8倍。生物转化参数再进行进一步工艺优化,本非粮途径的酶法制L-Phe仍有工业开发价值。