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背景:结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tb）导致的结核病（Tuberculosis,TB）是全球范围流行的重大传染性疾病,其主要原因是缺乏有效的疫苗。蛋白亚单位疫苗具有成分明确、易于规模化生产和安全性高等优点,但是其免疫原性低,通常需要联合佐剂使用。我们实验室前期构建的融合蛋白ESAT6-Rv2626c和Mtb10.4-Hsp X（合并简称为M4）分别联合脂质体DP佐剂（DDA-poly（I:C））的结核亚单位疫苗,可以激发小鼠产生保护性免疫应答。聚乳酸羟基乙酸（PLGA）和聚乙二醇（PEG）具有良好生物相容性,广泛应用于药物递送以及生物医学。为了研发生物相容性好的聚合物纳米颗粒佐剂,我们将其与结核融合蛋白M4联合应用形成新型蛋白亚单位疫苗。目的:本研究将PLGA与PEG缩合形成PLGA-PEG二嵌段共聚物,装载M4蛋白的PLGA-PEG纳米颗粒作为核心结构,表面修饰聚肌胞苷酸poly（I:C）免疫刺激分子,尝试开发一种生物相容性好的聚合物纳米颗粒疫苗（简称NP/M4）。通过研究纳米颗粒疫苗NP/M4的免疫原性,评价制备的纳米颗粒对M4的佐剂效应。方法:1.纳米颗粒的制备利用酰胺化反应将PLGA和NH2-PEG缩合形成PLGA-PEG二嵌段共聚物。通过红外光谱（FTIR）和核磁共振氢谱（1H NMR）验证共聚物的合成。利用复乳溶剂挥发法（W/O/W）制备装载M4蛋白的PLGA-PEG纳米颗粒。以聚多巴胺作为二级修饰平台,将免疫刺激分子poly（I:C）通过迈克尔加成反应,修饰到纳米颗粒表面,形成最终的PLGA-PEG-poly（I:C）纳米颗粒（简称NP）。通过多角度粒度仪测定PLGA-PEG纳米颗粒的粒径;利用扫描电镜,观察NP的大小和形态结构;离心收集上清,用BCA法测定蛋白浓度,计算NP的包封率和载药率;将纳米颗粒裂解后进行SDS-PAGE凝胶电泳,验证NP包裹M4的稳定性;用MTT法检测NP/M4对人单核巨噬细胞系THP-1细胞生长的影响。2.NP/M4的免疫原性评价选择C57BL/6雌性6-8w的小鼠为动物模型,免疫策略分组:（1）PBS组;（2）BCG组;（3）M4融合蛋白组;（4）DP联合融合蛋白M4组（DP/M4）;（5）纳米包封融合蛋白M4组（NP/M4）。滴鼻组:分别于0w和8w进行鼻腔滴注,其中BCG免疫的量为5×106CFU/只,M4组、DP/M4和NP/M4组每次免疫蛋白的量均为10μg/只。皮下免疫组:PBS、BCG和NP/M4组。皮下免疫程序与滴鼻组相同,作为对照组,探讨NP佐剂合适的递送途径。末次免疫6w后,用淋巴细胞分离液分离小鼠脾脏淋巴细胞,体外经Hsp X和Rv2626c抗原刺激。用流式细胞技术（FCM）测脾脏淋巴细胞IL-2和IFN-γ的表达;用ELISA检测脾脏淋巴细胞IFN-γ分泌水平;分离小鼠脾脏淋巴细胞,体外培养3d,加入Ed U,检测Hsp X和Rv2626c抗原刺激后CD4+T细胞的增殖能力;用ELISA检测肺泡灌洗液中s Ig A以及血清Ig G、Ig G1和Ig G2c抗体水平。结果:1.纳米颗粒的表征FTIR中和1H NMR结果证实了嵌段共聚物PLGA-PEG的合成。经粒度仪和扫描电镜观察,大部分纳米颗粒的直径分布在200-500nm,且分散系数（PDI）小于0.2。纳米颗粒的表面电荷最终为-32.97±0.42mv,包封率为73.25±1.63%,载药率为6.81±0.96%。经SDS-PAGE凝胶电泳证实M4蛋白可以较为稳定的包封于NP中。MTT实验结果表明该纳米颗粒不影响THP-1细胞的生长。2.免疫原性检测结果（1）滴鼻免疫NP/M4可以促进M4蛋白的细胞免疫:FCM结果显示,与DP/M4和M4组相比,NP/M4可以促进CD4+T细胞的增殖（P<0.01,P<0.001）;NP/M4组CD8+T细胞表达的IL-2和IFN-γ比M4组和BCG组明显更高（P<0.01,P<0.001）;ELISA结果显示,NP/M4组诱导的小鼠脾脏T淋巴细胞IFN-γ的分泌较M4组和BCG组高（P<0.05）。（2）滴鼻免疫NP/M4可以促进M4蛋白的体液免疫:ELISA法检测小鼠肺泡灌洗液和血清,NP/M4组较M4组,显著促进了肺泡灌洗液s Ig A;血清Ig G、Ig G1和Ig G2c抗体水平（P<0.05）。（3）NP/M4滴鼻与皮下免疫比较:FCM结果显示,NP/M4滴鼻免疫小鼠激活了更高的CD4+T细胞的增殖能力（P<0.01）;较皮下免疫,NP/M4滴鼻免疫小鼠,脾脏CD8+T细胞表达IL-2和IFN-γ水平更高（P<0.01,P<0.05）;ELISA结果显示,NP/M4滴鼻免疫诱导的小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ水平较皮下免疫高（P<0.01）。NP/M4在两种免疫途径均诱导了较M4更高的Ig G、Ig G1和Ig G2c抗体滴度。结论:我们成功制备了PLGA-PEG-poly（I:C）聚合物纳米颗粒NP,该纳米颗粒包裹结核融合蛋白M4滴鼻免疫小鼠后可有效地诱导细胞和体液免疫应答,有望成为结核亚单位疫苗候选纳米佐剂。