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随着全球人口日趋老龄化,心脑血管疾病已成为一类严重危害人类健康的疾病,发病率和死亡率居高不下。而作为这些严重心脑血管疾病起始病变的动脉粥样硬化(AS)是一种复杂的多因素疾病,发病机制尚不明确。研究AS的发病机制,对于发展中的AS防治策略有十分重大的意义。AS的发病机制主要有脂质浸润学说,血小板聚集和血栓形成学说以及损伤反应学说等,近年来多位学者在损伤反应学说的基础上提出了炎症反应学说,认为各种危险因素造成的动脉内膜损伤是AS的始动环节,而慢性炎症反应贯穿AS发生发展的始终。研究发现内皮细胞作为血管性疾病的第一道屏障与血液中的危险因素直接接触,其中ox-LDL(氧化性低密度脂蛋白)是导致内皮功能损伤的关键危险因素之一。受损内皮发生构象和生理学改变,分泌趋化因子和细胞因子等招募单核巨噬细胞等炎症细胞聚集,在受损血管局部放大炎症免疫反应,同时受损内皮细胞凋亡坏死,内皮屏障的完整性破坏,从而加剧动脉粥样硬化形成。IL-22是Renauld等于2000年发现的一种免疫介质,它由激活的T细胞、NK细胞等免疫细胞产生,特异性地作用于机体组织细胞,尤其是上皮细胞,而不影响免疫细胞功能。近期大量研究发现,IL-22在多种免疫炎症性疾病中发挥保护性或致病性的重要作用。研究发现,IL-22可能通过增强角质化细胞增殖、促进急性反应期蛋白及炎性细胞趋化因子等表达导致皮肤银屑病损伤;在小鼠关节炎中,IL-22通过抑制胶原和IgG生成促进组织炎症;IL-22在流感性及革兰氏阴性菌感染性肺炎中均参与介导了宿主防御功能;Sugimoto等在小鼠溃疡性结肠炎模型中发现,IL-22能够改善肠道炎症。然而目前较少研究涉及IL-22在心血管系统中的生物学作用。2006年Chang等发现内皮、平滑肌细胞等心血管非免疫细胞也是IL-22的作用靶点;2010年Gangemi发现IL-22可能与慢性心衰病程相关。提示IL-22可能参与心血管系统慢性炎症反应。基于以上研究现状,我们推测IL-22可能通过作用于血管内皮细胞或平滑肌细胞等参与血液中危险因子造成的血管慢性炎症,甚至动脉粥样硬化形成过程。那么,IL-22在动脉粥样硬化中发挥什么样的作用呢?它是否可以作为治疗靶点,协同其在老年人群高发疾病,如心衰,阻塞性肺疾病,脂肪肝,肠炎等中的作用,为人口老龄化带来福音呢?为了证实上述推论,我们从以下方面进行研究:1)检测动脉粥样硬化患者体内IL-22的表达情况,分析其与疾病的相关性; 2)测定IL-22受体在人血管内皮细胞的表达情况;3)利用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附实验(ELISA)技术等,筛选IL-22在ox-LDL致内皮损伤过程中可能参与调控的靶分子;4)通过体外细胞实验,验证IL-22对细胞功能的作用及其作用机制。第一部分动脉粥样硬化患者外周血IL-22的表达情况我们通过RT-PCR检测冠状动脉硬化性心脏病(CAD)患者外周血单个核细胞(PBMC)中的IL-22mRNA表达情况,ELISA检测其血清的表达水平,从基因和蛋白水平分析IL-22与动脉粥样硬化的相关性,为进一步了解IL-22在动脉粥样硬化中的作用提供线索和依据。结果显示,AS患者外周血PBMC中存在IL-22 mRNA的表达。将CAD患者按冠状动脉病变程度进行分组后统计分析发现,脉管狭窄程度<50%的冠脉早期病变患者组IL-22血清水平显著高于冠脉无狭窄患者组(P<0.01),且IL-22表达水平随冠脉狭窄程度和病变支数增加而呈现下降趋势。提示IL-22与动脉粥样硬化程度存在负相关性,且其可能在冠脉狭窄早期病变过程中发挥重要作用。而IL-22浓度与TCHO、TG、LDL-C表达量均未见明显相关性。第二部分IL-22参与氧化型低密度脂蛋白诱导的动脉粥样硬化作用机制研究我们的前部分研究表明IL-22与动脉粥样硬化存在相关性。那么IL-22是否直接作用于血管内皮细胞?它的高表达是否与AS的初始环节,ox-LDL所致的内皮损伤有关?基于这些疑问,我们首先检测IL-22受体在人血管内皮细胞的表达情况。实验一IL-22受体在人血管内皮的表达情况不同浓度ox-LDL刺激培养人脐静脉内皮细胞(CRL1730),分别收集不同作用时间(0h、6h、12h、24h、48h)的实验细胞,提取总RNA,使用实时荧光定量PCR方法检测IL-22R1 mRNA的相对表达水平;另一方面,使用PE标记的抗人IL-22R抗体对收集细胞进行胞外染色,检测其IL-22受体蛋白在细胞上的表达情况。结果显示,CRL1730细胞表达IL-22R,且其表达量受ox-LDL浓度和刺激时间影响。100μg/ml ox-LDL处理CRL1730细胞24小时后其IL-22R阳性细胞比例显著增高,差异有统计学意义(P<0.01)。实验二IL-22对ox-LDL刺激人脐静脉内皮细胞的分子表达变化影响上一部分实验验证了血管内皮细胞表面存在IL-22受体,且在ox-LDL刺激作用下呈动态变化,那么IL-22在血管内皮细胞尤其是ox-LDL刺激的内皮细胞上发挥怎样的作用呢?我们首先选择了7个与IL-22功能或内皮细胞损伤密切相关的基因COX-2,PGES,MCP-1,MMP1,ICAM,IL-6和Bcl-2利用RT-PCR及ELISA技术检测IL-22作用下ox-LDL损伤内皮细胞的相关分子表达变化情况,以此为切入点寻找IL-22的作用靶点,然后深入探讨其作用机制。我们的研究发现,加入IL-22后,ox-LDL损伤内皮细胞的Bcl-2和ICAM表达均显著增高(P<0.01)。实验三IL-22对ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响通过Annexin V- PI凋亡试剂盒检测实验我们发现,加入IL-22可明显抑制ox-LDL刺激诱导的内皮细胞凋亡(P<0.05);经实时荧光定量逆转录PCR检测发现IL-22促进抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl和Bcl-w表达,而降低Caspase3 mRNA表达(P<0.05);最后我们通过Western Blot实验发现IL-22作用1-2小时细胞内STAT3发生磷酸化, 4小时后Bcl-2蛋白表达显著升高。基于上述研究,我们推测IL-22可能通过磷酸化STAT3,直接或间接上调抗凋亡分子Bcl-2、Bcl-xl和Bcl-w的表达,抑制促凋亡分子Caspase3的表达,从而抑制ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡。综上所述,本研究初步发现IL-22与冠状动脉狭窄早期病变相关,且其对ox-LDL损伤内皮细胞的凋亡抑制作用尤为显著。IL-22可能通过调控受损内皮细胞的凋亡,修复受损内皮和维持其完整性,从而间接的减缓动脉粥样硬化的进程。