论文部分内容阅读
目的:通过胃癌细胞（体外）实验研究,观察高糖（High glucose,HG,25 m M）对胃癌细胞增殖与迁移的影响及Pin1/BRD4/NAP1L1/P21信号通路的作用,阐明高糖条件下Pin1/BRD4对胃癌细胞增殖与迁移的潜在作用机制;通过动物实验（体内）研究,观察链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）诱导的糖尿病（Diabetes mellitus,DM）移植瘤胃癌小鼠模型中,Pin1/BRD4对胃癌（Gastric cancer,GC）的增殖、转移的影响。方法:胃癌细胞（体外）实验:胃癌细胞分组:Ctrl组（空白对照组,D-葡萄糖:5.6 m M）、HG组（高糖组,D-葡萄糖:25 m M）、Mannitol组（甘露醇渗透压对照组,D-葡萄糖:5.6 m M+甘露醇:19.4 m M）、HG-Shpin1组（高糖-pin1基因沉默组）、HG-Sh NC组（高糖-荧光基因对照组）与HG-JQ1组(高糖-JQ1 10-6M治疗组)。Ed U试验和CCK-8试验检测胃癌细胞增殖水平;Transwell、划痕试验测胃癌细胞迁移率;利用流式细胞术检测细胞周期与细胞凋亡水平;通过蛋白免疫印迹试验（Western-blotting,WB）与Real-time PCR法测胃癌细胞Pin1、BRD4、NAP1L1、P21以及特异性增殖相关分子PCNA的表达水平;通过胃癌细胞系转染特异性Pin Sh RNA（short hairpin RNA,Sh RNA）慢病毒以及BRD4抑制剂JQ1(10-6M)干预,观察Pin1介导BRD4通路对胃癌细胞增殖及迁移的作用。动物（体内）实验:选取4周龄裸鼠通过腹腔注射100 mg/kg链尿佐菌素（STZ）构建糖尿病小鼠模型,并将各组相对应的MKN45胃癌细胞系通过皮下或尾静脉注射入小鼠体内,观察Pin1/BRD4在体内研究水平下对胃癌细胞生长、转移的影响;动物实验分组:Ctrl组（正常血糖组）、DM组（糖尿病组）、DM-Sh Pin1组（注射稳转Pin1沉默MKN45细胞）、DM-Sh-NC组（注射荧光对照MKN45细胞）、DM-JQ1（JQ1治疗组,JQ1:50 mg/kg）与、Ctrl-Sh-NC组（注射荧光对照MKN45细胞）;游标卡尺每隔三天定期测量腋下肿瘤大小;用小动物活体成像系统观察移植瘤与肺转移情况;血糖试纸（葡萄糖氧化）法测裸鼠的血糖水平;HE染色观察肿瘤组织学特点与肺转移情况;免疫组织化学法观察Pin1、BRD4、NAP1L1、P21在组织水平的表达情况,观察特异性增殖相关分子PCNA在组织中的表达情况。结果:胃癌细胞（体外）实验:（1）高糖微环境可显著促进胃癌细胞增殖与迁移,与Ctrl组相比,HG组胃癌细胞的增殖与迁移能力显著增加;通过转染慢病毒沉默Pin1基因或JQ1 10-6M干预抑制BRD4基因能显著抑制高糖诱导的胃癌细胞增殖与迁移,与HG组相比,HG-Shpin1组与HG-JQ1组胃癌细胞的代谢增殖活性与迁移水平均显著下降;（2）高糖暴露可促进胃癌细胞通过细胞周期G1/S期阻滞点,加速细胞周期进程并且抑制细胞凋亡,与Ctrl组相比,HG组在G0/G1期细胞数明显减少,S期细胞数显著增加,并且细胞凋亡率明显下降;抑制Pin1或BRD4基因,能显著抑制细胞周期进程并促进细胞凋亡水平;（3）与Ctrl组相比,高糖环境下可促进胃癌细胞Pin1、BRD4以及NAP1L1蛋白表达显著增加,并且抑制P21蛋白的表达;沉默Pin1/BRD4基因能够明显抑制NAP1L1的表达,而P21的表达显著升高;与HG组相比,通过JQ1抑制BRD4的表达,Pin1蛋白的表达水平并无明显差异;动物（体内）实验:（1）与Ctrl组相比,各组注射STZ（100 mg/kg）后血糖水平均显著增高;DM组,DM-Sh Pin1组、DM-Sh-NC组、DM-JQ1治疗组之间的小鼠血糖水平均无统计学差异;（2）裸鼠成瘤实验结果显示:与正常血糖组（Ctrl组、Ctrl+Sh-NC组）相比,糖尿病小鼠组（DM组、DM+Sh-NC组）肿瘤质量最大且生长最快;与糖尿病小鼠组（DM组、DM+Sh-NC组）相比,DM+JQ1组、DM+Sh-Pin1组的肿瘤质量明显变小并且生长缓慢;（3）小鼠尾静脉肺转移实验结果显示:通过小动物活体成像以及H&E染色观察胃癌肺部转移情况,高血糖能够明显促进胃癌细胞发生转移,与Ctrl-Sh-NC相比,DM-Sh-NC组在注射肿瘤细胞4周后出现了明显的肺部转移;与DM+Sh-NC组相比,DM+Sh-NC-JQ1组、DM+Sh-Pin1组的裸鼠肺部转移显著减少;（4）免疫组化试验结果显示:与正常血糖组（Ctrl组、Ctrl+Sh-NC组）相比,高血糖组（DM组、DM+Sh-NC组）Pin1、BRD4、NAP1L1以及PCNA的表达显著增高,而P21的表达明显降低;通过抑制Pin1或BRD4,NAP1L1以及PCNA的表达显著降低,P21的表达明显升高,在抑制BRD4的情况下Pin1的表达无明显改变。结论:1)沉默Pin1或BRD4均可抑制高糖作用下胃癌细胞增殖与迁移;2)沉默Pin1可抑制高糖诱导的胃癌细胞BRD4、NAP1L1以及PCNA的表达,上调P21的表达;3)沉默Pin1或BRD4均可降低糖尿病小鼠胃癌组织中NAP1L1及PCNA的表达,而上调P21的表达;4)沉默Pin1或BRD4均可抑制糖尿病合并胃癌小鼠的成瘤及肺转移过程;