慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）是我国慢性白血病中常见的一种类型，可发生于各年龄人群。虽然传统治疗药物羟基脲、干扰素等在一定时期内可以改善患者症状，但不能治愈本病，也不能阻断疾病进展。绝大多数患者在一段时期的慢性期后，进入加速期或急变期，最终因造血衰竭或感染等并发症而死亡。融合基因bcr/abl是慢性粒细胞白血病的遗传分子生物学特征，其产物Bcr/Abl激酶是发病的关键因素。因Bcr/Abl激酶具有强烈的酪氨酸激酶活性，目前酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）如伊马替尼等已作为白血病一线治疗药物应用于临床。在治疗中发现，伊马替尼对慢性粒细胞白血病慢性期有较好的治疗效果，但仍有部分患者发生耐药。研究表明，Bcr/Abl激酶可以激活细胞内Ras/MAPK、Jun/STAT5、PI3K/Akt/mTOR等多种信号通路，进而影响细胞周期分布以及细胞凋亡等，导致CML发病。其中，mTOR信号通路在CML对TKIs耐药机制中发挥重要作用，抑制mTOR信号通路的异常激活可能增强Bcr/Abl激酶阳性细胞对TKIs的敏感性，在慢性粒细胞白血病治疗中发挥作用。哺乳动物雷帕霉素靶点（mammalian target of rapamycin, mTOR）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在调节蛋白质合成、细胞周期分布、细胞增殖及凋亡等多个方面发挥重要作用。4E-BP1和p70S6K是mTOR下游两个重要的效应分子，是mTOR信号通路功能的主要执行者。mTOR激活可以导致4E-BP1和p70S6K磷酸化水平升高，在转录及翻译水平调节多种蛋白质的合成。研究发现，mTOR信号通路在胃癌、肾癌、小细胞肺癌、宫颈癌等多种人类肿瘤细胞中表达异常，与肿瘤的发生密切相关。此外，mTOR通路的激活可能参与了急性髓系白血病、淋巴瘤等血液系统恶性疾病的发生发展，且是Bcr/Abl阳性细胞恶性转化及早期生存过程中的关键环节。雷帕霉素（rapamycin，RAPA）是一种小分子mTOR活性抑制剂，属于大环内酯类化合物，最早作为免疫抑制剂应用于临床。有研究表明，雷帕霉素对体外培养的多种肿瘤细胞有明显的抑制作用。目前，雷帕霉素在白血病治疗中的作用机制以及mTOR能否成为慢性粒细胞白血病治疗中的靶点等问题尚不清楚，已引起学者们的广泛关注。因此，为了深入探讨mTOR信号通路在慢性粒细胞白血病发生中的作用以及mTOR抑制剂雷帕霉素对白血病的治疗作用，本实验从以下几个方面进行了研究：1.慢性粒细胞白血病患者骨髓细胞中mTOR通路的表达情况；2. mTOR抑制剂雷帕霉素对慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞周期分布以及细胞凋亡的影响；3.雷帕霉素对K562细胞mTOR通路相关分子表达的影响；4.雷帕霉素联合塞来昔布对慢性粒细胞白血病K562细胞的抑制作用。本文拟通过以上研究，深入分析mTOR信号通路在CML发生发展中的作用，为mTOR成为CML治疗新靶点提供理论依据。本研究论文分为四个部分：第一部分：mTOR、4E-BP1和p70S6K在慢性粒细胞白血病发病中的作用目的：通过检测mTOR及其效应分子4E-BP1、p70S6K在CML患者骨髓细胞中的表达，探讨mTOR信号通路在CML发病中的作用。方法：选取2009-2010年河北医科大学第二医院及河北省人民医院初治慢性期CML患者34例。运用Western Blot方法检测CML患者骨髓细胞中mTOR及其下游分子4E-BP1、p70S6K的蛋白表达及磷酸化情况。结果：1.1CML患者骨髓细胞mTOR及p-mTOR蛋白表达情况Western blot检测结果表明，mTOR在CML患者骨髓细胞中的阳性表达率为82.4%（28/34），对照组骨髓中的阳性表达率为60.0%（6/10），二者比较无明显差异（P>0.05）。进一步检测mTOR磷酸化水平，发现CML患者骨髓细胞中p-mTOR阳性表达率明显高于对照组（70.6%vs30.0%，P<0.05）。mTOR蛋白表达及其磷酸化水平与患者年龄、性别均无明显相关（P>0.05）。1.24E-BP1及p-4E-BP1在CML患者骨髓细胞中的表达检测结果表明，CML患者和对照组骨髓细胞中4E-BP1蛋白阳性表达率分别为88.2%（30/34）、80.0%(8/10)，二者比较无统计学意义（P>0.05）。然而，CML患者骨髓细胞中4E-BP1磷酸化水平却明显高于对照组（76.5%vs40.0%，P<0.05）。进一步分析4E-BP1蛋白表达及其磷酸化水平与患者临床病理资料的关系，结果表明4E-BP1、p-4E-BP1的表达与患者性别、年龄无明显相关（P>0.05）。1.3CML患者骨髓细胞中p70S6K及其磷酸化水平的检测结果Western blot检测结果表明，p70S6K在CML患者骨髓细胞中的阳性表达率为85.3%（29/34），在正常人群中的阳性表达率为70.0%（7/10），二者比较无明显差异（P>0.05）。进一步检测p70S6K磷酸化水平，发现CML患者骨髓细胞中p-p70S6K阳性表达率明显高于对照组（73.5%vs20.0%，P<0.05）。CML患者中，p70S6K及p-p70S6K表达与患者年龄、性别均无明显相关（P>0.05）。结论：慢性粒细胞白血病骨髓细胞中mTOR、4E-BP1和p70S6K的磷酸化水平明显增高，mTOR途径被激活，提示mTOR途径在慢性粒细胞白血病的发病中发挥重要作用。第二部分：mTOR抑制剂雷帕霉素对慢性粒细胞白血病K562细胞周期分布和凋亡的影响目的：通过检测mTOR抑制剂雷帕霉素对K562细胞周期分布、细胞增殖及细胞凋亡的影响，探讨雷帕霉素对K562细胞株的抑制作用。方法：不同浓度雷帕霉素处理K562细胞株后，采用MTT法检测细胞增殖情况，运用流式细胞分析技术、RT-PCR以及Western Blot检测细胞周期分布的变化及细胞凋亡情况。结果：2.1雷帕霉素对K562细胞存活率的影响MTT检测结果发现，雷帕霉素对K562细胞生长有明显抑制作用。经雷帕霉素处理24h后，20、40、80、100、200、500、1000nmol/L处理组K562细胞存活率均明显低于溶剂对照组（P<0.05）。在20～1000nmol/L浓度范围内，随着雷帕霉素浓度的升高K562细胞存活率均明显降低。而1、5、10nmol/L浓度雷帕霉素处理组对K562细胞存活率无明显影响（P>0.05）。2.2雷帕霉素对K562细胞周期分布的影响FCM结果表明，雷帕霉素处理24h、48h后，处理组G0/G1期细胞比对照组显著增多，而S期细胞比例则明显降低（P<0.05）。各处理组G2/M期细胞所占比例无明显变化。提示雷帕霉素可显著影响K562细胞周期分布，诱导细胞G0/G1期阻滞。进一步分析雷帕霉素作用时间对细胞周期分布的影响，发现20nmol/L、40nmol/L、80nmol/L及160nmol/L浓度雷帕霉素作用48h后G0/G1期细胞比例明显高于作用24h（P<0.05），10nmol/L雷帕霉素作用时间对G0/G1期细胞比例无明显影响（P>0.05）。10nmol/L~80nmol/L浓度雷帕霉素作用48h比24h后S期细胞明显减少（P<0.05），160nmol/L浓度组作用24h、48h后S期细胞比例相比无显著差异（P>0.05）。2.3雷帕霉素对细胞周期关键因子CyclinD1、p21以及CyclinB1的影响采用RT-PCR方法检测雷帕霉素处理对K562细胞细胞周期关键分子表达的影响，以GAPDH mRNA表达作为内参照。结果显示，20nmol/L、40nmol/L及80nmol/L雷帕霉素处理组CyclinD1mRNA表达明显低于对照组（P<0.05）。给予不同浓度雷帕霉素作用24h后，40nmol/L和80nmol/L雷帕霉素处理组p21mRNA表达量分别为0.642±0.069和1.094±0.161，明显高于对照组（0.206±0.033，P<0.05），而20nmol/L雷帕霉素处理组p21mRNA表达与对照组相比无明显差异（P>0.05）。雷帕霉素各浓度处理组CyclinB1mRNA表达与对照组相比均无统计学意义（P>0.05）。2.4雷帕霉素对K562细胞凋亡率的影响采用Annexin V-PI双染凋亡试剂盒检测雷帕霉素对K562细胞凋亡率的影响。凋亡细胞分为早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞两部分。结果显示，雷帕霉素各浓度处理组K562细胞凋亡率明显高于对照组（P<0.05）。进一步分析早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞比率，发现雷帕霉素20nmol/L、40nmol/L和80nmol/L浓度作用24h后，早期凋亡细胞比率分别为9.53±1.10%、11.47±0.90%和15.90±1.67%，均明显高于对照组（P<0.05）。而40nmol/L和80nmol/L浓度处理组晚期凋亡细胞比率明显高于对照组（P<0.05），20nmol/L浓度处理组与对照组晚期凋亡细胞比率无显著差异（P>0.05）。结果提示，雷帕霉素可诱导K562细胞发生凋亡，且主要影响细胞早期凋亡。2.5雷帕霉素对凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2的影响Caspase是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶，雷帕霉素作用24h后对照组及各浓度雷帕霉素处理组均在32kD位置（酶原）出现荧光阳性条带，而雷帕霉素20nmol/L、40nmol/L及80nmol/L处理组在17kD的位置出现Caspase-3的活性片段。结果表明雷帕霉素可以激活K562细胞中的Caspase-3，其诱导的细胞凋亡可能与Caspase-3激活有关。采用Western Blot检测Bcl-2蛋白的表达，发现雷帕霉素20nmol/L、40nmol/L、80nmol/L处理组Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.977±0.150、0.733±0.123、0.603±0.095，其中40nmol/L、80nmol/L浓度处理组Bcl-2蛋白表达量显著低于对照组（1.080±0.137, P<0.05）。结论：mTOR靶向抑制剂雷帕霉素可影响细胞周期、凋亡关键分子的表达，诱导细胞G0/G1期阻滞以及凋亡。第三部分：雷帕霉素对K562细胞mTOR通路相关分子表达的影响目的：通过检测雷帕霉素对K562细胞中mTOR及其下游分子mRNA、蛋白表达的影响，探讨雷帕霉素抑制K562细胞生长及诱导凋亡的可能机制。方法：采用Western Blot、RT-PCR方法检测雷帕霉素对K562细胞内mTOR、4E-BP1及p70S6K mRNA、蛋白表达及其磷酸化水平。结果：3.1雷帕霉素对K562细胞mTOR及p-mTOR表达的影响mTOR蛋白分子量为289kD，经SDS-PAGE电泳、转膜后，K562细胞对照组、雷帕霉素处理组均在289kD位置出现荧光条带。以GAPDH（38kD）作为参照，经图像分析系统对荧光条带进行定量分析，结果显示，雷帕霉素对mTOR蛋白表达无明显影响（P>0.05），但可以显著降低mTOR蛋白磷酸化水平（P<0.05）。RT-PCR结果显示，各浓度雷帕霉素处理组细胞内mTOR mRNA表达量与对照组相比无明显差异（P>0.05）。3.24E-BP1及p-4E-BP1在K562细胞中表达采用Western Blot技术观察雷帕霉素对K562细胞中4E-BP1蛋白去磷酸化和磷酸化水平的影响。结果显示，雷帕霉素处理组4E-BP1和p-4E-BP1蛋白表达均明显低于对照组（P<0.05）。运用RT-PCR检测4E-BP1在mRNA水平上的表达。结果表明，各浓度雷帕霉素处理组细胞内4E-BP1mRNA表达量比对照组均明显降低（P<0.05）。结果提示，雷帕霉素可降低mTOR下游4E-BP1mRNA以及蛋白的表达，同时可影响其磷酸化。3.3雷帕霉素对K562细胞p70S6K及p-p70S6K表达的影响Western Blot结果显示，雷帕霉素处理组p70S6K蛋白表达及磷酸化水平均明显低于对照组（P<0.05）。RT-PCR结果表明，20nmol/L、40nmol/L、80nmol/L雷帕霉素处理组细胞内p70S6K mRNA表达量分别为0.633±0.067、0.513±0.057、0.403±0.051，比对照组明显降低（0.801±0.077，P<0.05）。结果提示，雷帕霉素可抑制p70S6K的表达及磷酸化水平。结论：雷帕霉素可通过抑制mTOR及其下游底物4E-BP1和p70S6K的活性，诱导细胞G0/G1期阻滞以及细胞凋亡，进而抑制肿瘤细胞的生长。第四部分：雷帕霉素联合塞来昔布对慢性粒细胞白血病的抑制及其机制目的：通过观察雷帕霉素联合塞来昔布对K562细胞增殖、凋亡以及mTOR信号通路的影响，探讨雷帕霉素与塞来昔布对K562细胞的协同抑制作用及可能机制。方法：选用低浓度雷帕霉素（20nmol/L）联合低浓度塞来昔布（10μmol/L）处理K562细胞株，采用流式细胞学技术、RT-PCR及WesternBlot方法检测细胞凋亡、mTOR通路相关分子的表达。结果：4.1塞来昔布对K562细胞存活率的影响采用MTT方法检测不同浓度塞来昔布对K562细胞存活率的影响。结果显示，塞来昔布对K562细胞生长有明显抑制作用。塞来昔布处理24h及48h后，10、20、40、80、160μmol/L处理组K562细胞存活率均明显低于溶剂对照组（P<0.05）。在10～160μmol/L浓度范围内，随着塞来昔布浓度的升高K562细胞存活率明显降低。5μmol/L浓度塞来昔布处理对K562细胞存活率无明显影响（P>0.05）。4.2雷帕霉素联合塞来昔布对K562存活率的影响观察雷帕霉素联合塞来昔布对K562细胞株细胞存活率的影响，结果表明，联合用药组细胞存活率比对照组、雷帕霉素及塞来昔布单药组明显降低（P<0.05）。结果提示联合用药可明显抑制K562细胞的增殖。4.3雷帕霉素联合塞来昔布对K562细胞凋亡率的影响采用Annexin V-PI双染凋亡试剂盒检测雷帕霉素联合塞来昔布对K562细胞凋亡率的影响。结果显示，20nmol/L雷帕霉素处理组、10μmol/L塞来昔布处理组及两药联合处理组细胞凋亡率均明显高于对照组（P<0.05）；而且联合用药组细胞凋亡率为15.87±2.21%，比各单药处理组明显升高（P<0.05）。进一步比较不同处理措施对早期凋亡和晚期凋亡的影响，结果发现雷帕霉素处理组细胞早期凋亡率比对照组明显增多（6.03±0.70%vs4.23±0.35%，P<0.05），而塞来昔布处理组细胞晚期凋亡率明显高于对照组（4.17±0.61%vs2.27±0.25%，P<0.05）。联合用药组细胞早期凋亡率与晚期凋亡率均比对照组明显增高（P<0.05）。结果提示，雷帕霉素及塞来昔布单药均可诱导K562细胞发生凋亡，二者联合用药可增强单药诱导细胞凋亡的作用，在诱导细胞凋亡中可能具有协同作用。4.4雷帕霉素联合塞来昔布对mTOR信号通路相关分子的影响Western Blot检测结果表明，雷帕霉素及塞来昔布联合处理组mTOR蛋白表达及磷酸化水平均明显低于对照组（P<0.05）。雷帕霉素及塞来昔布单药对K562细胞中mTOR蛋白表达无明显影响，但可显著降低mTOR磷酸化水平（P<0.05）。另外，联合用药组mTOR及p-mTOR均明显低于单药处理组（P<0.05）。RT-PCR结果显示，雷帕霉素、塞来昔布单药作用24h后，K562细胞mTOR mRNA表达与对照组无明显差异（P>0.05），而联合用药组mTOR mRNA相对表达量为0.280±0.046，明显低于对照组（0.707±0.059，P<0.05），与单药作用组相比也明显降低（P<0.05）。结果提示，联合用药可降低K562细胞mTOR在mRNA、蛋白水平的表达及其磷酸化水平。运用Western Blot方法检测4E-BP1和p-4E-BP1的表达。结果表明，雷帕霉素、塞来昔布单药及联合用药组4E-BP1蛋白表达及磷酸化水平均明显低于对照组（P<0.05），而且联合用药组4E-BP1和p-4E-BP1比单药处理组降低的更为明显（P<0.05）。RT-PCR检测结果发现，雷帕霉素、塞来昔布单药及联合用药组4E-BP1mRNA相对表达量分别为1.437±0.150、1.373±0.127、0.723±0.084，均比对照组（1.697±0.160）明显减少（P<0.05）。进一步比较单药处理组及联合用药组4E-BP1mRNA表达的变化，结果表明联合用药后K562细胞内4E-BP1mRNA表达明显减少（P<0.05）。雷帕霉素、塞来昔布单药及联合用药作用于K562细胞24h后，药物处理组p70S6K蛋白表达及磷酸化水平均明显低于对照组（P<0.05），而且联合用药其表达水平明显低于单药处理组。RT-PCR结果与蛋白检测结果一致，单药及联合用药组K562细胞内p70S6K mRNA相对表达量比对照组明显减少（P<0.05），联合用药组p70S6K mRNA表达比单药处理明显降低（P<0.05）。结论：雷帕霉素联合塞来昔布可明显抑制K562细胞增殖、诱导细胞凋亡，而且联合用药可增强单药对K562细胞的生长抑制作用。结论：1慢性粒细胞白血病骨髓细胞中mTOR、4E-BP1和p70S6K的磷酸化水平明显增高，mTOR途径被激活，提示mTOR途径在慢性粒细胞白血病的发病中发挥重要作用。2mTOR靶向抑制剂雷帕霉素可影响细胞周期、凋亡关键分子的表达，诱导细胞G0/G1期阻滞以及凋亡。3雷帕霉素可通过抑制mTOR及其下游底物4E-BP1和p70S6K的活性，诱导细胞G0/G1期阻滞以及细胞凋亡，进而抑制肿瘤细胞的生长。4雷帕霉素联合塞来昔布可明显抑制K562细胞增殖、诱导细胞凋亡，而且联合用药可增强单药对K562细胞的生长抑制作用。