慢病毒介导Survivin体外转染人髓核细胞的生物学效应

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目的:研究慢病毒介导的生存素(Survivin)基因在体外转染人退变椎间盘髓核细胞的生物学效应。方法:取腰椎间盘突出症患者手术切除的髓核组织,应用细胞培养技术获得人髓核细胞;用含有Survivin基因的重组慢病毒载体转染人退变髓核细胞作为实验组,阴性对照组转入等量的空病毒颗粒,空白对照组加入等量的PBS;通过Real-Time P CR技术检测Survivin基因转染后的表达情况;应用AnnexinV-PI双染法,通过流式细胞仪检测退变髓核细胞的凋亡率;应用Caspase-3活性检测试剂盒,通过酶标仪检测髓核细胞裂解液中Caspase-3的酶活性。结果:原代髓核细胞培养7天左右开始贴壁增长,髓核细胞呈多角形,可见长短不一的突起结构,细胞核呈圆形,核中可见2-3个圆形的核仁,培养30天左右细胞达90%融合;在MOI=50时,慢病毒Survivin基因载体转染效率可达到90%;髓核细胞转染后1周左右可到达90%融合,细胞的增长和细胞形态无明显改变;在传代之后髓核细胞增长减慢且细胞形态发生改变,胞质浓缩,细胞体积变小,细胞突起变细变长;髓核细胞在转染后1周,Real-Time PCR结果显示实验组Survivin mRNA的表达量(139.55±7.43)明显高于阴性对照组(1.43±0.16)及空白对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);髓核细胞凋亡率检测结果实验组为(2.44±0.14)、阴性对照组为(2.36±0.14)及空白对照组为(2.43±0.20),三组组间比较差异无统计学意义(P>0.05);Caspase-3吸光度检测结果实验组为(0.115±0.01)、阴性对照组为(0.101±0.02)及为空白对照组(0.099±0.01),三组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:(1)慢病毒介导的Survivin基因在体外成功转染人退变髓核细胞并且获得过表达;(2)慢病毒介导的Survivin基因转染人退变髓核细胞后引起髓核细胞增长减慢及细胞形态学的改变,对髓核细胞的凋亡无明显抑制作用。
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