研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,Meth),俗称冰毒,是目前最为常见的精神兴奋剂之一,其中神经系统是Meth作用的主要靶系统之一,近年来,随着分子生物学技术及在体成像技术的广泛应用,中枢炎症在Meth神经损伤中的作用日益凸显。神经炎症主要是由脑内小胶质细胞过度激活引起的生理反应。Peli1蛋白具有E3泛素化连接酶的作用,在小胶质细胞炎性反应中具有特异性。TLR4是小胶质细胞表面的主要受体,可以活化MyD88和TRIF两条通路,激活NF-κB通路促进炎性因子的表达。有文献报道,Peli1激活TRIF依赖性TLR信号通路,促进炎性因子的释放。我们前期的实验发现,Meth可以激活小胶质细胞,TLR4,Peli1蛋白表达升高,诱导MAPKs和NF-κB通路激活,引起炎性因子的释放,产生炎性反应,因此我们推测TLR4-Peli1可能作为关键信号轴在Meth引起的神经炎性反应中起重要作用。研究目的:探讨TLR4-Peli1信号通路在Meth诱导小胶质细胞炎性反应中的作用。研究方法:建立Meth急性染毒的小鼠模型,随机分为三个剂量组,每组17只,对照组(生理盐水),低剂量Meth组(10 mg/kg)和高剂量Meth组(30 mg/kg),采用腹腔注射的给药方式,一天内连续给药四次,时间点分别是上午八点、十点、十二点、下午两点。给药后高剂量Meth组(30 mg/kg)死亡4只。在小鼠海马组织中利用western blot技术检测TLR4、Peli1、MyD88和TRIF等蛋白的变化情况,同时检测MAPKs和NF-κB通路激活情况。通过慢病毒转染技术,在BV2细胞上低表达Peli1,观察MAPKs和NF-κB通路的变化情况,和细胞因子IL-6、IL-12P70和TNF-α分泌水平的变化。利用CCK-8试剂盒测定TLR4抑制剂TAK242对BV2细胞活力的影响,在不影响细胞活力的前提下筛选TAK242最佳作用剂量。通过对TLR4抑制及敲减的方法,观察Meth作用小胶质细胞后,Peli1、TRIF和MyD88蛋白和下游MAPK、NF-κB通路磷酸化蛋白表达和炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1β的变化情况。在BV2细胞上通过si RNA干扰技术对TRIF和MyD88分别进行基因水平敲减,通过RT-PCR和western blot技术观察Peli1蛋白的变化情况。结果:1.甲基苯丙胺对小鼠海马TLR4、Peli1及信号通路影响TLR4、MyD88、TRIF和Peli1在低剂量Meth组(10 mg/kg)和高剂量Meth组(30 mg/kg)蛋白表达量均出现显著上调。与对照组比较,Meth低剂量组(10mg/kg)及高剂量组(30 mg/kg)均可促进MAPK通路的不同程度的激活,表现为p-ERK、p-JNK和p-p38蛋白表达升高。NF-κB磷酸化蛋白水平表达显著升高。2.Peli1在甲基苯丙胺诱导小胶质细胞炎症反应中的作用Peli1敲减组中Peli1蛋白表达量明显低于空载体组,Meth(300μM)作用下,对比空载体组,Peli1敲减后Meth给药组NF-κB磷酸化水平显著降低。Peli1低表达后,Meth(300μM)作用下,对比空载体转染组,ERK磷酸化水平明显降低,Peli1转染组p38的磷酸化水平显著低于空载体组(p<0.01),Peli1转染组JNK磷酸化水平也发生降低(p<0.05)。Peli1敲减Meth处理组,与空载体组Meth处理组相比,细胞IL-6、IL-12P70和TNF-α分泌水平表达均下降。3.TLR4抑制剂TAK242对Meth诱导小胶质细胞TLR4蛋白及其下游信号通路的影响20μM的TAK242开始对BV2细胞具有损伤作用,30μM的TAK242作用剂量显著降低细胞活力。不同浓度的TAK242对TLR4的表达均具明显的抑制效果,尤其15μM的浓度作用下,TLR4抑制效果最明显,下游MyD88和TRIF亦出现不同程度的降低,TLR4抑制后,MAPKs通路(ERK、p38、JNK)磷酸化水平均出现不同程度降低,NF-κB磷酸化水平亦明显下调。筛选TAK242(15μM)作用后,TLR4蛋白表达量显著下降,MyD88、TRIF和Peli1也出现降低的趋势,且MAPKs通路(ERK、p38、JNK MAPK)磷酸化水平均出现不同程度降低,NF-κB磷酸化水平降低。预先加入TAK242(15μM)后,与Meth单独处理组比较,Meth引起的IL-6、TNF-α和IL-1β等细胞炎性因子的表达显著降低。4.siRNA干扰TLR4后对Meth诱导小胶质细胞炎性反应及其下游信号蛋白的影响TLR4干扰组的蛋白水平明显低于空载体组,说明干扰效果较好。与单独Meth处理组比较,TLR4干扰组Meth作用后MyD88、TRIF及下游Peli1的表达下降。TLR4干扰组MAPKs通路(ERK、p38 MAPK),NF-κB磷酸化水平出现不同程度降低,该结果与TLR4抑制剂的结果基本一致。5.MyD88依赖性和非依赖性通道对甲基苯丙胺诱导小胶质细胞Peli1的影响MyD88进行si RNA干扰后,干扰组与空载体组相比,MyD88的mRNA和蛋白表达显著降低,说明MyD88的干扰效果较好,对MyD88进行si RNA干扰后,Peli1的m RNA和蛋白表达未见明显改变,与m RNA表达水平的结果一致。通过对TRIF进行si RNA干扰,继而给予Meth(300μM)作用24 h,给药前,TRIF干扰组和空载体相比,TRIF的m RNA水平和蛋白水平都出现降低;给药后(300μM Meth),与空载体组相比,TRIF干扰组Peli1的m RNA和蛋白水平均出现降低。研究结论:1.Meth急性染毒小鼠大脑海马组织中TLR4、TRIF、MyD88和Peli1等蛋白表达上升,MAPKs和NF-κB通路激活,表现为ERK、JNK、P38和NF-κB磷酸化水平增高,提示Meth介导的神经炎症反应。2.Peli1作为Peli家族成员中小胶质细胞表面主要表达的受体,当其敲减后,下游MAPKs和NF-κB通路磷酸化水平降低,IL-6、TNF-α和IL-12P70等细胞炎性因子表达水平下降,提示在Meth诱导的小胶质细胞中,Peli1可能作为关键点介导炎性作用。3.作为小胶质细胞表面的主要Toll样家族受体之一,在Meth诱导的小胶质细胞炎性反应过程中,TLR4对下游炎性通路和炎性因子的分泌产生调节作用。表现为TLR4抑制后,Peli1水平下降,MAPKs和NF-κB通路磷酸化水平降低,提示TLR4可能作为Peli1的上游对Meth诱导的小胶质细胞的炎性反应进行调节。4.对MyD88和TRIF分别进行干扰,发现Meth诱导的小胶质细胞炎性反应中,TLR4对Peli1的调节可能是通过MyD88非依赖性TRIF通路实现的。