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研究背景基底神经节（Basal ganglia,BG）是锥体外系调控运动、精细行为、强化学习、情感动机的核心结构。纹状体是BG主要的输入输出核团,主要接受来自皮层和丘脑的兴奋性谷氨酸（glutamine,GLU）神经元投射,以及黑质致密部的多巴胺（dopamine,DA）神经元投射,即黑质-纹状体环路。黑质-纹状体环路是BG重要的神经环路之一,该环路的功能损伤主要表现为运动功能障碍,如手足徐动症、亨廷顿舞蹈症、帕金森氏综合症等,并伴随记忆、认知、精神障碍。因此,深入研究黑质-纹状体局部环路功能调控机制,对于指导运动、认知、精神障碍的治疗具有重要意义。抑制性的中型棘状神经元（medium spiny neurons,MSNs）是纹状体主要分布的输出神经元。其中,黑质投射而来的DA可激活MSNs上的D1受体,解除MSNs对下游脑区的抑制效应。在此过程中,乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh）对纹状体D1-MSNs信号传递有重要的调控作用。根据文献报道,毒蕈碱乙酰胆碱能受体（Muscarinic acetylcholine receptors,m ACh Rs）是ACh主要作用的受体和功能单元,包括五种m ACh Rs亚型,其中毒蕈碱M4受体（Muscarinic M4 receptors,M4）受体特异性的分布于D1-MSNs,并且占纹状体分布总m ACh Rs亚型的45%之多。目前,M4受体如何参与ACh对纹状体D1-MSNs信号传递的调控作用仍不清楚。细胞周期素依赖性激酶5（Cyclin-dependent Kinase 5,CDK5）对诸多信号传导分子、神经调节蛋白、骨架蛋白等底物蛋白的丝氨酸/苏氨酸位点具有特异性的磷酸化作用,且其特异性激活蛋白p35/25广泛的分布于中枢神经系统中。在D1-MSNs的DA信号传递过程中,CDK5通过自身激酶活性调控DA和cAMP调节的磷酸蛋白（dopamine and AMP-regulated phosphoprotein,DARPP-32）调控DA信号转导。CDK5通过调控DARPP-32的Thr75位点磷酸化,抑制DARPP-32的Thr34磷酸化,负性调控纹状体D1-MSNs的DA信号转导。根据本课题组前期研究发现,M4受体对MSNs的DARPP-32 Thr75磷酸化具有特异性的调控作用。但M4受体自身没有激酶活性,提示:M4通过调控DARPP-32 Thr75的上游激酶CDK5介导纹状体内源性ACh发挥生物学功能调控。且M4/CDK5/DARPP-32 p-Thr75这一细胞内分子信号机制极可能参与调控基底神经节黑质-纹状体环路及其介导的运动、认知、精神功能等。故本课题围绕这一关键问题从细胞、环路、功能多层次开展研究。研究目的（1）在体外培养的纹状体MSNs,探究M4调控DARPP-32 Thr75磷酸化的细胞内分子信号机制。（2）利用CRSPR/Cas9介导的基因编辑技术构建背侧纹状体M4受体敲减小鼠模型,探讨M4对CDK5/DARPP-32 p-Thr75在体调控作用及M4/CDK5/DARPP-32p-Thr75信号通路参与平衡纹状体DA对D1-MSNs的神经元的兴奋性电活动及其依赖的行为调控机制。（3）在D1-M4-KO转基因小鼠上特异性损毁黑质多巴胺能神经元,探讨M4/CDK5/DARPP-32 p-Thr75对基底神经节DA依赖的黑质-纹状体环路调控机制。研究方法（1）在体外培养成熟的MSNs,使用M4受体拮抗剂MT 3（0.1μM）或CDK5抑制剂Seliciclib（10μM）处理MSNs后,与非胆碱能受体激动剂Oxo-M（Oxo-M,1μM）共孵育。通过蛋白免疫印迹检测CDK5、p35/25及DARPP-32 p-Thr75的表达;利用免激光共聚焦断层扫描成像,检测M4与CDK5在MSNs的分布特点,统计细胞三维结构中XZ、YZ、XY轴的皮尔逊相关系数（Pearson’s correlation,PCC）和曼德尔共定位系数（Mandoner’s correlation,MCC）评估M4受体激活和上调的CDK5荧光表达之间共定位及相关性;通过免疫共沉淀进一步揭示M4与CDK5、及CDK5激活分子p35/25蛋白之间相互作用。（2）采用脑立体定位将LV/Cas9-M4-sg RNA注入小鼠背侧纹状体（dorsal striatum,DS）区,并在注射后第14天分别用免疫荧光染色、蛋白免疫印迹检测DS区M4受体的表达。同时,在DS-M4-KD小鼠模型上给予Oxo-M处理后,利用自发活动实验、疲劳转棒实验检测小鼠运动行为学改变;免疫荧光和蛋白免疫印迹检测CDK5及DARPP-32 p-Thr75的表达;全细胞膜片钳记录MSNs的m EPSC的频率变化。（3）在增强纹状体M4受体对ACh的反应（预先给予WT小鼠M4受体的正向调节剂VU0467154）,或直接激动M4受体（预先给予DS-M4-KD小鼠非选择性m ACh Rs激动剂Oxo-M）的情况下,并联合D1受体激动剂SKF82958诱导多巴胺信号通路激活。利用免疫荧光、蛋白免疫印迹检测小鼠DARPP-32的Thr75/Thr34的磷酸化平衡改变;使用自发活动、强迫游泳行为和震惊反射探究M4受体对抗多巴胺D1受体激活依赖的行为学改变。（4）采用脑立体定位将LV/Cas9-CDK5-sg RNA注入小鼠DS区,构建基于CRISPR/cas9介导的背侧纹状体CDK5敲低（DS-CDK5-KD）小鼠模型。在DS-CDK5-KD小鼠模型上,使用蛋白免疫印迹检测DS区CDK5及突触形成蛋白的表达;采用高尔基染色方法检测CDK5缺失之后DS区神经元的树突以及树突棘变化;AAV顺行示踪病毒标记DS-CDK5-KD小鼠的DS区投射的下游脑区。（5）通过Cre-loxp系统构建Chrm4flox/flox-Dr D1Cre+/-（D1-M4-KO）小鼠。使用MPTP诱导小鼠黑质多巴胺能神经元的损毁。自发活动,疲劳仪转棒实验评价小鼠运动行为损伤改变,声电穿梭箱及认知墙评价小鼠认知行为损伤改变。免疫荧光及蛋白免疫印迹检测CDK5及其下游信号分子DARPP-32 p-Thr75、Tau、GS3Kβ的表达。研究结果（1）根据蛋白免疫印迹结果显示,Oxo-M可以浓度依赖性的上调CDK5及其激活分子p35/25的表达。而预先给予CDK5抑制剂或M4受体拮抗剂MT3预处理MSNs后,Oxo-M无法上调CDK5的表达及DARPP-32 Thr75的磷酸化。根据激光共聚焦断层三维扫描结果,M4与CDK5在MSNs三维结构中XZ、YZ、XY轴的PCC的值为:XZ=0.77±0.05;XY=0.96±0.09;YZ=0.8±0.06。MCC的值为:XZ=0.95±0.02;XZ=0.91±0.01;YZ=0.96±0.04。两相关系数均趋近“1”。结合免疫共沉淀结果显示,经Oxo-M处理的MSNs细胞裂解液中,M4能共沉淀CDK5及CDK5特异性激活分子p35/25蛋白,CDK5及p35/25抗体能够共沉淀M4。（2）与对照组（生理盐水,i.c.v,2μL）相比,Oxo-M（0.1μM,i.c.v,2μL）可显著降低DS-M4-NC小鼠的自发活动总距离（p＜0.001）和落棒潜伏期（p＜0.01）。而对DS-M4-KD小鼠的自发活动总距离和落棒潜伏期均无显著性改变。根据蛋白免疫印迹结果显示,与对照组相比,Oxo-M可显著上调DS-M4-NC小鼠的CDK5表达（p＜0.001）及DARPP-32 Thr75的磷酸化（p＜0.001）,而对DS-M4-KD小鼠CDK5表达及DARPP-32 Thr75的磷酸化无显著上调作用。全细胞膜片钳结果显示,与对照组相比,Oxo-M可显著抑制DS-M4-NC小鼠DS区MSNs的m EPSCs释放频率（p＜0.001）。而对DS-M4-KD小鼠的m EPSPs释放频率无显著作用。（3）与SKF82958组相比,预先给予DS-M4-NC小鼠Oxo-M（0.1μM,i.c.v,2μL）处理10 min后,可抑制对SKF82958诱导的DARPP-32 p-Thr34的表达（p＜0.001）。同时,Oxo-M显著抑制了SKF82958诱导的运动行为易化作用、精神活动的增加。而在DS-M4-KD小鼠中,与SKF82958组相比,预先给予Oxo-M（0.1μM,i.c.v,2μL）处理10 min,对SKF82958诱导的DARPP-32 p-Thr34荧光强度及蛋白表达水平无显著抑制作用,且对SKF82958在自发活动、强迫游泳及震惊反射实验中的行为表现无逆转作用。全细胞膜片钳结果显示,与SKF82958组相比,10μM Oxo-M可使SKF82958诱导的m EPSC频率显著降低（p＜0.001）,而在DS-M4-KD小鼠的DS区,Oxo-M对SKF82958诱导的m EPSC抑制作用被翻转。（4）高尔基染色结果显示,与DS-CDK5-NC小鼠相比,在DS区CDK5缺失后,MSNs神经元树突长度缩短（p＜0.001）,且树突棘密度变得稀疏（p＜0.001）。且在DS-CDK5-KD小鼠的DS区可检测到突触形成蛋白MAP2、PSD-95、synapsin I的显著降低,即CDK5的缺失干扰了树突延长、分支和树突棘的形成。AAV-h Syn-m Cherry顺行追踪法标记DS-CDK5-KD小鼠的MSNs对下游脑区的投射。与DS-CDK5-NC小鼠相比,小鼠DS区CDK5缺失能降低DS区对M2（p＜0.01）、Tha（p＜0.001）和BLA（p＜0.001）的神经投射。（5）在WT及D1-M4-KO小鼠给予经MPTP进行定向损毁黑质-纹状体DA神经元投射后。在WT与MPTP模型小鼠,AAV-h Syn-m Cherry顺行示踪研究表明M2,Pir,PRh,BMP以及SNr信号强度存在显著性差异。这些神经核团与运动、认知有着密切关联。行为学实验显示,经MPTP处理的WT小鼠在运动量、运动协调性方面有显著损伤,而D1-M4-KO小鼠一定程度上缓解了由MPTP损毁造成运动量、运动协调性的损伤。结合穿梭箱、认知墙实验结果显示,经MPTP损毁造模后,WT小鼠的反应能力、认知能力均有不同程度的下降,而D1-M4-KO小鼠一定程度上缓解了由MPTP损毁造成的认知损伤。免疫荧光结果显示,MPTP可上调WT小鼠的CDK5的表达及DARPP-32 p-Thr75位点的磷酸化,伴随Tau与GSk3β蛋白的磷酸化显著上调。D1-M4-KO小鼠一定程度上缓解了由MPTP损毁造成CDK5,DARPP-32 p-Thr75,p-Tau,p-GSk3β的显著上调。研究结论（1）本课题研究在MSNs细胞水平及动物水平上,确证M4受体对CDK5-DARPP-32 Thr75磷酸化信号通路的调控作用,该机制参与M4受体介导的基底节纹状体“DA-ACh”的平衡调控。（2）CDK5介导M4对纹状体DA功能的平衡调控,参与纹状体MSNs突触的形成、传递,从而影响MSNs对下游脑区的投射调控。（3）D1-M4-KO小鼠可拮抗MPTP诱导的CDK5活性增加,下调DARPP-32p-Thr75,p-Tau,p-GSk3β的磷酸化表达,改善MPTP致使小鼠的运动及认知障碍。